Анализ крови фотометрия

Анализ крови фотометрия

Стр 1 из 3Следующая ⇒

 

В работе с фотометрической аппаратурой любого типа следует соблюдать условия измерений, рекомендуемые методикой выполнения анализа.

Таких условий, как правило, три:

■ толщина рабочего слоя фотометрической кюветы

■ длина световой волны

■ способ расчета результатов исследований.

 

ТОЛЩИНА РАБОЧЕГО СЛОЯ КЮВЕТЫ ограничивает длину пути светового луча в исследуемом растворе и оптическая плотность вещества в растворе находится в прямо пропорциональной зависимости от этой величины, то есть, чем толще рабочий слой кюветы, тем выше будет оптическая плотность измеряемых в ней растворов вещества. Для измерении с помощью фотоэлектроколориметра (в видимой части спектра) применяются оптические кюветы из обычного стекла, чаще с толщиной рабочего слоя 5 мм и 10 мм, реже применяются 3-мм кюветы. Для измерений в ультрафиолетовой области спектра (Спектрофотометр, флуориметр) используются кюветы, изготовленные из материала, не поглощающего ультрафиолетовые лучи, обычно это увиолевое, реже кварцевое стекло. Толщина рабочего слоя таких кювет — 10 мм.

 

ДЛИНА СВЕТОВОЙ ВОЛНЫ (λ), которая указывается в методиках, определяется физико-химическими свойствами исследуемых растворов. Чисто визуальным проявлением таких свойств может быть прозрачность и окраска растворов. Данные два качества могут сочетаться в следующих трех вариантах:

1. Прозрачные, неокрашенные растворы;

2. Мутные, неокрашенные растворы;

3. Прозрачные, окрашенные растворы.

Строго говоря, возможен и такой вариант как «мутные, окрашенные» растворы, но такие растворы исследованию не подлежат, либо, если это крайне необходимо, их исследуют, что сопряжено с целым рядом трудностей и возможных неточностей (постановка контроля на мутность и пр.)

Первый вариант — прозрачные, неокрашенные растворы, используются в клинической биохимии при проведении, так называемого, оптического теста Варбурга. В этом случае измерения связаны с регистрацией в ультрафиолетовой области величины оптической плотности НАД при его окислении либо восстановлении. Используется длина световой волны — 340 нм.

Второй вариант — исследование экстинкции мутных, неокрашенных растворов, относится к нефелометрии и проводится при длине световой волны — 540 нм ( зеленый светофильтр), либо — 640 нм (красный светофильтр).

Третий вариант — исследование прозрачных, окрашенных растворов. Длина световой волны здесь обусловлена принципом дополнительности цветов исследуемого раствора и светофильтра. Например, при измерениях растворов, окрашенных в желтый цвет, используется длина световой волны 440 нм (синий светофильтр) и, наоборот, при измерениях растворов синего цвета — 590 нм (желтый светофильтр), иногда — 640 нм (красный светофильтр).

Если в методике не оговорены толщина рабочего слоя кюветы и длина световой волны, то исследователь, внедряющий методику, подбирает эти константы самостоятельно, сообразуясь с окраской полученной реакционной смеси и техническими особенностями имеющейся фотометрической аппаратуры. Для большинства фотоэлектроколориметров область оптической плотности, с наименьшим процентом погрешностей измерений, лежит в пределах 0,2-0,5 экстинкций. Значения оптической плотности ниже, либо выше указанных, увеличивают процент возможных ошибок измерений. Поэтому, выбирая толщину рабочего слоя кюветы, ориентируются на указанные оптимальные пределы оптической плотности, а также на объем реакционной смеси с тем, чтобы кювета могла быть заполнена до необходимого уровня.

Для заполнения обычной прямоугольной 10мм кюветы достаточно 4 мл раствора, а для 5 мм кюветы — 2 мл раствора Для заполнения квадратной 10 мм кюветы необходимо не более 2 мл раствора.

В ряде случаев, исходя из особенностей методики, либо с целью экономии реактивов, можно, вместо прямоугольных кювет, применить квадратные с такой же толщиной рабочего слоя, так как для их заполнения требуется в два раза меньший объем реактивов. Для этого необходимо изготовить держатель квадратной кюветы (чтобы избежать погрешностей в измерениях). Длину световой волны подбирают, как уже говорилось, по принципу дополнительности цветов. Причем измерения проводят на двух, трех длинах волн, близлежащих к предполагаемой. Останавливаются на той длине волны, которая дает наибольшую оптическую плотность, но, опять же, в пределах указанного оптимума экстинкций. Это связано с тем, что чем выше значения оптической, плотности, тем меньше будет цена одного деления шкалы оптических плотностей и тем меньше будет величина возможных случайных ошибок в самом процессе измерений.

 

СПОСОБОВ РАСЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ исследования, применяемых на сегодняшний день в клинической биохимии, можно привести, по крайней мере, четыре:

■ использование условных единиц;

■ расчеты по стандартным (эталонным) растворам;

■ расчеты по калибровочному графику;

■ расчеты по коэффициенту пересчета.

 

УСЛОВНЫЕ ЕДИНИЦЫ (У.Е.) — наиболее примитивный вариант обозначения результатов анализа. Применительно к фотометрическому анализу у.е. — единицы оптической плотности исследуемого раствора. В у.е. до сих пор обозначаются результаты определения серомукоидов, сиаловых кислот, бета- липопротеидов. Иногда рекомендуется преобразовывать у.е. (единицы оптической плотности), умножая их на коэффициент «100», либо «1000» для выражения у.е. в более целых числах. Считается, что после преобразования они более удобны для прочтения. Например, в исследованиях на сиаловые кислоты пределы физиологической нормы в Условных единицах обозначаются как 130-200 у.е. Это соответствует экстинкции 0,13- 0,20, умноженной на коэффициент «1000».

 



Источник: mykonspekts.ru

Читайте также

Добавить комментарий