Анализ крови презентация

Анализ крови презентация

ИФА — метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой

пероксидаза хрена (о-фенилендиамин, тетраметилбензидин) щелочная фосфатаза (фосфорные эфиры) бета-галактозидаза

Дозаторы: одноканальные пипетки — 5–40, 40–200 и 200–1000 мкл; 8-канальные — 5–50 и 50–200 мкл; Вошер Холодильник с морозильной камерой Термостат Шейкер Спектрофотометр планшетный (ридер) Дистиллятор Набор мерной химической посуды

Варианты ИФА ИФА Гомогенный Гетерогенный

Варианты ИФА ИФА Конкурентный Сэндвич

Исправное оборудование. Достаточная (высокая) квалификация персонала. Соблюдение правил при подготовке исследуемых образцов. Правильный выбор тест-систем, соблюдение условий их доставки и хранения. Соблюдение правил при подготовке и постановке ИФА. Правильный учет и интерпретация результатов. Внешний и внутрилабораторный контроль качества.

Спектрофотометр (набором эталонных фильтров с различной оптической плотностью). Пипетки (гравиметрическим способом, взвешивая дистиллированную воду 10%, 50%, 100% от полного объема шкалы пипетки). Термометры (относительно эталонного термометра).

Смешать 1:1 дистиллированную воду и 1М серную кислоту; разлить по 200 мкл во все лунки планшета (планшет предварительно должен быть промыт р-ром ФСБ-Т); измерить оптическую плотность на 450 нм относительно воздуха; ОП не должна превышать 0,05.

Необходимы метрологическим путем поверенные весы и разновесы. Выставить пипетку на объём 50 % от полного объёма шкалы пипетки (или наиболее часто используемый объём). Отобрать соответствующее количество дистиллированной воды. Вылить воду в сухую, предварительно взвешенную, пробирку и сделать повторное взвешивание. 1 мкл – 1 мг

Необходимо в термостате на полке иметь термометр (поверенный). В термостатах без вентилирования температура в разных зонах камеры может существенно различаться. В современных термостатах, как правило, есть вентилятор создающий равномерность температуры по всему объему.

Необходимо следить за состоянием каналов; их засорение приводит к снижению эффективности отмывки. Требуется ежедневная промывка системы дистиллированной водой (не оставляйте вошер заполненным промывочным раствором на ночь). Наличие микробиологических заростов в шлангах, каналах, ёмкостях уменьшает специфичность анализа. Обязательно, как минимум, раз в неделю промывать всю систему вошера 70% спиртом или другим раствором, рекомендованным инструкцией к прибору.

Правильная настройка дистиллятора, обеспечивающая требуемое качество дистиллированной воды: удельная проводимость при 20 °С — не более 0,0005 см/м, рН 5,0-7,0. Периодическая профилактическая чистка дистиллятора. Стерилизация шлангов и бутылей ( автоклавирование, прожаривание в сухожаре ) с целью исключения контаминации воды.

Сыворотка крови Завершённое формирование фибринового сгустка (фибрин – источник ложноположительных результатов) Исключить возможность контаминации одного образца другим (использование индивидуальных стеклянных палочек или наконечников для обведения сгустка). Возможен частичный гемолиз, но не допускается клеточная взвесь (видно по преципитации эритроцитов в лунках планшета). Сыворотки должны быть без проростов, при длительном хранении (более 3 дней) лучше заморозить. Плазма Должна быть свободна от тромбоцитов.

Исследуемые и контрольные образцы — потенциально инфекционный материал! Работать в резиновых перчатках и медицинских масках. Оставшиеся исследуемые образцы, посуду и наконечники, с ними контактировавшие, замачивать в 6% перекиси водорода. Посуда и наконечники, не контактировавшие с образцами, не требуют дезинфекции. Поверхность стола, пипетки, перчатки в процессе работы дезинфицировать только 70% спиртом. Категорически запрещается использовать для этого растворы перекиси водорода, хлорамина или гипохлорита натрия.

Желательно одноразовое использование наконечников, особенно используемых для работы с конъюгатом и субстратным раствором. В случае невозможности одноразового использования наконечники для сывороток, конъюгата и субстратного раствора должны быть разделены. Замачивание для инактивации в перекиси водорода только наконечников, используемых для дозирования сывороток. Для конъюгата и субстратного раствора в одной тест-системе можно несколько раз использовать наконечники. В этом случае после использования ополоснуть их в дист. воде, 70% спирте и сложить в подписанную (название тест-системы, «конъюгат» или «ТМБ») чашку Петри.

замачивание в 6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства на 24 часа категорически запрещается использование моющих средств с биологически активными веществами и СМС в виде любых стиральных порошков! промывка 10 раз холодной водой промывка 2 раза дистиллированной водой кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 30 минут сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или поместить в 70% спирт не менее чем на 2 часа, а затем высушить при комнатной температуре на воздухе раскладка наконечников в штативы пинцетом!

Внимательно изучить инструкцию по применению тест-системы. Не использовать тест-системы с истекшим сроком годности. Не смешивать реактивы из разных серий наборов. Компоненты набора перед началом ИФА должны быть прогреты до комнатной температуры. Разборный планшет перед вскрытием необходимо выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин для предотвращения конденсации влаги. Кристаллы в концентрате отмывающего буфера должны быть растворены.

Сухие компоненты набора должны быть восстановлены заранее и выдержаны не менее 15 мин до использования. Неиспользованные стрипы должны быть немедленно упакованы и тщательно запечатаны в пакет для планшета с влагопоглотителем. Необходимо следить за состоянием влажной камеры – исключить бактериальные заросты (желательно камеру готовить ежедневно); влажная камера должна быть предварительно прогрета до температуры инкубации. ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ

Строгое выполнение условий проведения ИФА, указанных в инструкции!

Контролировать качество вносимых исследуемых образцов (отсутствие сгустков, клеточных элементов крови, прозрачность). При внесении образца в разводящий раствор – тщательное перемешивание пипетированием. Исключить манипуляции с образцами над рабочим планшетом. Продолжительность внесения образцов в лунки должна составлять не более 20-30% от времени инкубации.

Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельно выделенные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. При одновременной инкубации сыворотки и конъюгата – раствор конъюгата вносить, не касаясь наконечниками сывороточного раствора.

Контроль температуры в термостате (по дополнительному термометру). Предварительный прогрев влажной камеры (если она используется). Тщательное заклеивание планшета клейкой плёнкой, предотвращающее испарение жидкости. Размещение планшетов в один слой. Строгое соблюдение продолжительности инкубации.

Соответствие состояния промывающих устройств требованиям: равномерность внесения-удаления промывочного раствора, чистота ёмкостей и шлангов. Полное заполнение лунок промывочным раствором и полное его удаление в каждом цикле промывки. Время экспозиции промывочного раствора в лунке при каждом цикле промывки должно быть не менее 10 сек (если не оговорено по-другому в инструкции). Тщательное удаление влаги из лунок после промывки. Не допускать подсыхания лунок между операциями. Смена фильтровальной бумаги на разных стадиях постановки ИФА.

Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. Категорически недопустимо перекрёстное использование посуды и наконечников для работы с разными хромогенами. Исключить воздействие прямого солнечного света.

Исключить воздействие света. Соответствие температуры инкубации требованиям (18-25 ° С). Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Визуальный контроль характера окрашивания раствора в лунках (неравномерное окрашивание, появление окрашенных капель на стенках лунок – результат некачественной работы).

При внесении стоп-реагента необходимо добиваться полного перемешивания растворов (не пипетированием)

Исправный, поверенный спектрофотометр. Предварительный прогрев прибора. Сопоставить визуальную оценку планшета с распечаткой. Причиной повышенной ОП могут быть: загрязнение дна лунки, дефект пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра. Исключить влияние артефактов позволяет измерение ОП относительно фильтра 620 нм

Оценить соответствие полученных контрольных значений ОП требованиям, заложенным в инструкции по применению (валидность теста). Сопоставить полученные контрольные значения ОП с паспортными (при правильно проведённом анализе не должно быть существенных отличий).

При определении антигена — минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест-системой. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

Уменьшение времени инкубации (как правило, субстратной реакции). Использование загрязнённой посуды и наконечников. Замачивание посуды и наконечников в перекиси водорода или хлорсодержащих растворах без последующего кипячения в процессе мытья. Обработка рабочих поверхностей, пипеток, перчаток в процессе работы перекисью водорода или хлорсодержащими растворами. Плохая отмывка после инкубации сывороток в тестах, выявляющих антитела. Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры. Размещение планшетов в термостате стопкой. Низкая температура в лабораторных комнатах. Нарушение правил и сроков хранения вскрытых компонентов при дробном использовании набора.

Контаминированный вошер или низкого качества дистиллированная вода. Плохая отмывка на стадии конъюгата. Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации. Неправильная работа с пипетками (контаминация пипетки, неправильное дозирование). Неправильное использование влажной камеры, липкой пленки, приводящее к подсыханию раствора. Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ). Нерастворенные кристаллы в концентрате отмывающего раствора. Заросшие или с наличием клеточных элементов сыворотки. Неисправный планшетный спектрофотометр.

источник

Описание презентации по отдельным слайдам:

Современные лабораторные технологии (ИФА, ПЦР, проточная цитометрия) Подготовила — Кажимова А. Проверил (а) – Омарова Л.А.

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это лабораторное исследование, основанное на реакции «антиген-антитело». Суть этого лабораторного метода — выявление специфических антител с помощью специальных биохимических реакций, которые помогают определить присутствие или отсутствие антител и их количество. Методом ИФА можно определить уровень гормонов, иммуноглобулинов, иммунологических комплексов и других биологически активных веществ.

Принцип проведения иммуноферментного анализа крови При попадании в организм человека чужеродного агента (антигена) система иммунитета начинает вырабатывать специфические белки (антитела), которые необходимы для уничтожения антигенов. Антитела избирательно связываются с антигенами, образуя комплексы антиген-антитело. В ходе иммуноферментного анализа именно данный комплекс и подвергается качественному и количественному анализу. К примеру, если необходимо выявить определенный вирус (а точнее его антиген) в крови, в нее добавляют специфические к вирусу антитела. Наоборот, для выявления антител в образцы крови добавляются специфические антигены. Материалом для проведения иммуноферментного анализа является кровь, взятая из вены. Помимо крови для ИФА могут понадобиться околоплодные воды и материал стекловидного тела.

Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA) Метод непрямого иммуноаналза характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах. Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA) Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа. Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay) В данном варианте иммуноанализа используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

Расшифровка результатов анализа Иммуноферментный анализ крови позволяет выявить антитела разных видов. Это иммуноглобулины класса А, М, G. Накопление данных антител происходит в различные промежутки времени. Например, первыми после начала заболевания (на пятый день) начинают накапливаться иммуноглобулины класса М. Эти иммуноглобулины циркулируют в организме примерно 5-6 недель, после чего постепенно исчезают. В этот временной промежуток и выявляются иммуноглобулины данного класса. Примерно через 3-4 недели после заболевания появляются иммуноглобулины G, которые могут задерживаться в организме человека в течение нескольких месяцев. Однако этого может и не отмечаться. При проведении иммуноферментного анализа может отмечаться возрастание иммуноглобулинов G, что свидетельствует о наличие инфекционного процесса или реинфекции. Иммуноглобулины А обнаруживаются в крови на протяжении 2-4 недель, однако всего 20% из них находятся в сыворотке крови, остальные 80% содержатся в секрете слизистых оболочек. Как правило, антитела класса А исчезают в период времени от 2 недель до 2 месяцев. Такая динамика свидетельствует об уничтожении инфекционного процесса. Если же после выздоровления результат иммуноферментного анализа все равно показывает наличие иммуноглобулинов А, то это свидетельство хронизации инфекционного процесса.

Преимущества иммуноферментного анализа высокая чувствительность и точность метода; возможность проведения ранней диагностики, поскольку ИФА позволяет определять классы иммуноглобулинов при анализе; прослеживание динамики инфекционного процесса; возможность получения быстрого ответа; удобство метода. Недостатки Основным недостатком иммуноферментного анализа является тот факт, что в редких случаях метод выдает ложноотрицательные или ложноположительные результаты.

ПЦР Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя. ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты: ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать; два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента; термостабильная ДНК-полимераза; дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T); ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы; буферный раствор. ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 — 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 — 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 — 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называетсяденатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 — 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 — 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 — 2 минут. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадияэлонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 — 15 мин.

Проточная цитометрия (ПЦ) представляет собой технику для быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии. Методика обладает целым рядом преимуществ перед традиционной цитометрией, в числе которых: возможность исследования в ходе одного анализа значительно большего числа клеток (более 100000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток), что позволяет получать статистически достоверные результаты и выявлять редкие типы клеток; возможность проведения количественных измерений путем дифференцировки интенсивности рассеяния/флуоресценции при различных длинах волн; возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки. Проточная цитометрия

Типичный аппарат для проведения проточной цитометрии позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т.п. Кроме того, исследование отдельно взятых клеток даёт возможность выявить и оценить степень гетерогенности популяции, что не всегда может быть достигнуто другими методами. В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов. Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия. Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов.

источник

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ИФА — метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. — презентация

Презентация была опубликована 5 лет назад пользователемМарина Южикова

Презентация на тему: » ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. ИФА — метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой.» — Транскрипт:

2 ИФА — метод выявления антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой

3 Ферменты пероксидаза хрена пероксидаза хрена (о-фенилендиамин, тетраметилбензидин) (о-фенилендиамин, тетраметилбензидин) щелочная фосфатаза щелочная фосфатаза (фосфорные эфиры) (фосфорные эфиры) бета-галактозидаза бета-галактозидаза

4 Оборудование Дозаторы: Дозаторы: одноканальные пипетки — 5–40, 40–200 и 200– 1000 мкл; 8-канальные — 5–50 и 50–200 мкл; Вошер Вошер Холодильник с морозильной камерой Холодильник с морозильной камерой Термостат Термостат Шейкер Шейкер Спектрофотометр планшетный (ридер) Спектрофотометр планшетный (ридер) Дистиллятор Дистиллятор Набор мерной химической посуды Набор мерной химической посуды

5 Варианты ИФА ИФА ГомогенныйГетерогенный

6 Варианты ИФА ИФА КонкурентныйСэндвич

8 ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КАЧЕСТВА ИФА Исправное оборудование. Исправное оборудование. Достаточная (высокая) квалификация персонала. Достаточная (высокая) квалификация персонала. Соблюдение правил при подготовке исследуемых образцов. Соблюдение правил при подготовке исследуемых образцов. Правильный выбор тест-систем, соблюдение условий их доставки и хранения. Правильный выбор тест-систем, соблюдение условий их доставки и хранения. Соблюдение правил при подготовке и постановке ИФА. Соблюдение правил при подготовке и постановке ИФА. Правильный учет и интерпретация результатов. Правильный учет и интерпретация результатов. Внешний и внутрилабораторный контроль качества. Внешний и внутрилабораторный контроль качества.

9 Средства измерения, подлежащие метрологической поверке Спектрофотометр (набором эталонных фильтров с различной оптической плотностью). Спектрофотометр (набором эталонных фильтров с различной оптической плотностью). Пипетки (гравиметрическим способом, взвешивая дистиллированную воду 10%, 50%, 100% от полного объема шкалы пипетки). Пипетки (гравиметрическим способом, взвешивая дистиллированную воду 10%, 50%, 100% от полного объема шкалы пипетки). Термометры (относительно эталонного термометра). Термометры (относительно эталонного термометра).

10 КОНТРОЛЬ РАБОТЫ ПЛАНШЕТНОГО СПЕКТРОФОТОМЕТРА Смешать 1:1 дистиллированную воду и 1М серную кислоту; Смешать 1:1 дистиллированную воду и 1М серную кислоту; разлить по 200 мкл во все лунки планшета (планшет предварительно должен быть промыт р-ром ФСБ-Т); разлить по 200 мкл во все лунки планшета (планшет предварительно должен быть промыт р-ром ФСБ-Т); измерить оптическую плотность на 450 нм относительно воздуха; измерить оптическую плотность на 450 нм относительно воздуха; ОП не должна превышать 0,05. ОП не должна превышать 0,05.

11 КОНТРОЛЬ РАБОТЫ АВТОМАТИЧЕСКИХ ПИПЕТОК Необходимы метрологическим путем поверенные весы и разновесы. Необходимы метрологическим путем поверенные весы и разновесы. Выставить пипетку на объём 50 % от полного объёма шкалы пипетки (или наиболее часто используемый объём). Выставить пипетку на объём 50 % от полного объёма шкалы пипетки (или наиболее часто используемый объём). Отобрать соответствующее количество дистиллированной воды. Отобрать соответствующее количество дистиллированной воды. Вылить воду в сухую, предварительно взвешенную, пробирку и сделать повторное взвешивание. Вылить воду в сухую, предварительно взвешенную, пробирку и сделать повторное взвешивание. 1 мкл – 1 мг 1 мкл – 1 мг

12 ТЕРМОСТАТ Необходимо в термостате на полке иметь термометр (поверенный). Необходимо в термостате на полке иметь термометр (поверенный). В термостатах без вентилирования температура в разных зонах камеры может существенно различаться. В термостатах без вентилирования температура в разных зонах камеры может существенно различаться. В современных термостатах, как правило, есть вентилятор создающий равномерность температуры по всему объему. В современных термостатах, как правило, есть вентилятор создающий равномерность температуры по всему объему.

13 АВТОМАТИЧЕСКИЕ ВОШЕРЫ И РУЧНЫЕ ГРЕБЁНКИ Необходимо следить за состоянием каналов; их засорение приводит к снижению эффективности отмывки. Необходимо следить за состоянием каналов; их засорение приводит к снижению эффективности отмывки. Требуется ежедневная промывка системы дистиллированной водой (не оставляйте вошер заполненным промывочным раствором на ночь). Требуется ежедневная промывка системы дистиллированной водой (не оставляйте вошер заполненным промывочным раствором на ночь). Наличие микробиологических заростов в шлангах, каналах, ёмкостях уменьшает специфичность анализа. Наличие микробиологических заростов в шлангах, каналах, ёмкостях уменьшает специфичность анализа. Обязательно, как минимум, раз в неделю промывать всю систему вошера 70% спиртом или другим раствором, рекомендованным инструкцией к прибору. Обязательно, как минимум, раз в неделю промывать всю систему вошера 70% спиртом или другим раствором, рекомендованным инструкцией к прибору.

14 ДИСТИЛЛЯТОР Правильная настройка дистиллятора, обеспечивающая требуемое качество дистиллированной воды: удельная проводимость при 20 °С не более 0,0005 см/м, рН 5,0-7,0. Правильная настройка дистиллятора, обеспечивающая требуемое качество дистиллированной воды: удельная проводимость при 20 °С не более 0,0005 см/м, рН 5,0-7,0. Периодическая профилактическая чистка дистиллятора. Периодическая профилактическая чистка дистиллятора. Стерилизация шлангов и бутылей (автоклавирование, прожаривание в сухожаре) с целью исключения контаминации воды. Стерилизация шлангов и бутылей (автоклавирование, прожаривание в сухожаре) с целью исключения контаминации воды.

15 ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Сыворотка крови Сыворотка крови Завершённое формирование фибринового сгустка Завершённое формирование фибринового сгустка (фибрин – источник ложноположительных результатов) (фибрин – источник ложноположительных результатов) Исключить возможность контаминации одного образца другим (использование индивидуальных стеклянных палочек или наконечников для обведения сгустка). Исключить возможность контаминации одного образца другим (использование индивидуальных стеклянных палочек или наконечников для обведения сгустка). Возможен частичный гемолиз, но не допускается клеточная взвесь (видно по преципитации эритроцитов в лунках планшета). Возможен частичный гемолиз, но не допускается клеточная взвесь (видно по преципитации эритроцитов в лунках планшета). Сыворотки должны быть без проростов, при длительном хранении (более 3 дней) лучше заморозить. Сыворотки должны быть без проростов, при длительном хранении (более 3 дней) лучше заморозить. Плазма Плазма Должна быть свободна от тромбоцитов. Должна быть свободна от тромбоцитов.

16 ПРАВИЛА ДЕЗИНФЕКЦИИ В ЛАБОРАТОРИИ Исследуемые и контрольные образцы — потенциально инфекционный материал! Работать в резиновых перчатках и медицинских масках. Оставшиеся исследуемые образцы, посуду и наконечники, с ними контактировавшие, замачивать в 6% перекиси водорода. Посуда и наконечники, не контактировавшие с образцами, не требуют дезинфекции. Поверхность стола, пипетки, перчатки в процессе работы дезинфицировать только 70% спиртом. Категорически запрещается использовать для этого растворы перекиси водорода, хлорамина или гипохлорита натрия.

17 Работа с наконечниками для автоматических пипеток Желательно одноразовое использование наконечников, особенно используемых для работы с конъюгатом и субстратным раствором. Желательно одноразовое использование наконечников, особенно используемых для работы с конъюгатом и субстратным раствором. В случае невозможности одноразового использования наконечники для сывороток, конъюгата и субстратного раствора должны быть разделены. Замачивание для инактивации в перекиси водорода только наконечников, используемых для дозирования сывороток. В случае невозможности одноразового использования наконечники для сывороток, конъюгата и субстратного раствора должны быть разделены. Замачивание для инактивации в перекиси водорода только наконечников, используемых для дозирования сывороток. Для конъюгата и субстратного раствора в одной тест- системе можно несколько раз использовать наконечники. В этом случае после использования ополоснуть их в дист. воде, 70% спирте и сложить в подписанную (название тест-системы, «конъюгат» или «ТМБ») чашку Петри. Для конъюгата и субстратного раствора в одной тест- системе можно несколько раз использовать наконечники. В этом случае после использования ополоснуть их в дист. воде, 70% спирте и сложить в подписанную (название тест-системы, «конъюгат» или «ТМБ») чашку Петри.

18 Методика мытья наконечников замачивание в 6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства на 24 часа замачивание в 6% перекиси водорода, можно с 0,5% жидкого моющего средства на 24 часа категорически запрещается использование моющих средств с биологически активными веществами и СМС в виде любых стиральных порошков! категорически запрещается использование моющих средств с биологически активными веществами и СМС в виде любых стиральных порошков! промывка 10 раз холодной водой промывка 10 раз холодной водой промывка 2 раза дистиллированной водой промывка 2 раза дистиллированной водой кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 30 минут кипячение в третьей порции дистиллированной воды не менее 30 минут сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или поместить в 70% спирт не менее чем на 2 часа, а затем высушить при комнатной температуре на воздухе сухожар 80° С не менее 5 – 6 часов до полного высыхания или поместить в 70% спирт не менее чем на 2 часа, а затем высушить при комнатной температуре на воздухе раскладка наконечников в штативы пинцетом! раскладка наконечников в штативы пинцетом!

19 ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ Внимательно изучить инструкцию по применению тест-системы. Внимательно изучить инструкцию по применению тест-системы. Не использовать тест-системы с истекшим сроком годности. Не использовать тест-системы с истекшим сроком годности. Не смешивать реактивы из разных серий наборов. Не смешивать реактивы из разных серий наборов. Компоненты набора перед началом ИФА должны быть прогреты до комнатной температуры. Компоненты набора перед началом ИФА должны быть прогреты до комнатной температуры. Разборный планшет перед вскрытием необходимо выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин для предотвращения конденсации влаги. Разборный планшет перед вскрытием необходимо выдержать при комнатной температуре не менее 30 мин для предотвращения конденсации влаги. Кристаллы в концентрате отмывающего буфера должны быть растворены. Кристаллы в концентрате отмывающего буфера должны быть растворены.

20 Сухие компоненты набора должны быть восстановлены заранее и выдержаны не менее 15 мин до использования. Сухие компоненты набора должны быть восстановлены заранее и выдержаны не менее 15 мин до использования. Неиспользованные стрипы должны быть немедленно упакованы и тщательно запечатаны в пакет для планшета с влагопоглотителем. Неиспользованные стрипы должны быть немедленно упакованы и тщательно запечатаны в пакет для планшета с влагопоглотителем. Необходимо следить за состоянием влажной камеры – исключить бактериальные заросты (желательно камеру готовить ежедневно); влажная камера должна быть предварительно прогрета до температуры инкубации. Необходимо следить за состоянием влажной камеры – исключить бактериальные заросты (желательно камеру готовить ежедневно); влажная камера должна быть предварительно прогрета до температуры инкубации. ПОДГОТОВКА К РАБОТЕ

21 ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ Строгое выполнение условий проведения ИФА, Строгое выполнение условий проведения ИФА, указанных в инструкции!

22 ВНЕСЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Контролировать качество вносимых исследуемых образцов (отсутствие сгустков, клеточных элементов крови, прозрачность). Контролировать качество вносимых исследуемых образцов (отсутствие сгустков, клеточных элементов крови, прозрачность). При внесении образца в разводящий раствор – тщательное перемешивание пипетированием. При внесении образца в разводящий раствор – тщательное перемешивание пипетированием. Исключить манипуляции с образцами над рабочим планшетом. Исключить манипуляции с образцами над рабочим планшетом. Продолжительность внесения образцов в лунки должна составлять не более 20-30% от времени инкубации. Продолжительность внесения образцов в лунки должна составлять не более 20-30% от времени инкубации.

23 ВНЕСЕНИЕ КОНЪЮГАТА Использовать одноразовую посуду и наконечники. Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельно выделенные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. При повторном использовании – отдельно выделенные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. При одновременной инкубации сыворотки и конъюгата – раствор конъюгата вносить, не касаясь наконечниками сывороточного раствора. При одновременной инкубации сыворотки и конъюгата – раствор конъюгата вносить, не касаясь наконечниками сывороточного раствора.

24 ИНКУБАЦИЯ Контроль температуры в термостате (по дополнительному термометру). Контроль температуры в термостате (по дополнительному термометру). Предварительный прогрев влажной камеры (если она используется). Предварительный прогрев влажной камеры (если она используется). Тщательное заклеивание планшета клейкой плёнкой, предотвращающее испарение жидкости. Тщательное заклеивание планшета клейкой плёнкой, предотвращающее испарение жидкости. Размещение планшетов в один слой. Размещение планшетов в один слой. Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Строгое соблюдение продолжительности инкубации.

25 ПРОМЫВКА ПЛАНШЕТА Соответствие состояния промывающих устройств требованиям: равномерность внесения-удаления промывочного раствора, чистота ёмкостей и шлангов. Соответствие состояния промывающих устройств требованиям: равномерность внесения-удаления промывочного раствора, чистота ёмкостей и шлангов. Полное заполнение лунок промывочным раствором и полное его удаление в каждом цикле промывки. Полное заполнение лунок промывочным раствором и полное его удаление в каждом цикле промывки. Время экспозиции промывочного раствора в лунке при каждом цикле промывки должно быть не менее 10 сек (если не оговорено по-другому в инструкции). Время экспозиции промывочного раствора в лунке при каждом цикле промывки должно быть не менее 10 сек (если не оговорено по-другому в инструкции). Тщательное удаление влаги из лунок после промывки. Тщательное удаление влаги из лунок после промывки. Не допускать подсыхания лунок между операциями. Не допускать подсыхания лунок между операциями. Смена фильтровальной бумаги на разных стадиях постановки ИФА. Смена фильтровальной бумаги на разных стадиях постановки ИФА.

26 ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ВНЕСЕНИЕ РАСТВОРА ХРОМОГЕНА Использовать одноразовую посуду и наконечники. Использовать одноразовую посуду и наконечники. При повторном использовании – отдельные наконечники и посуда, которые При повторном использовании – отдельные наконечники и посуда, которые не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. не обрабатывать дезинфицирующими и моющими средствами. Категорически недопустимо перекрёстное использование посуды и наконечников для работы с разными хромогенами. Категорически недопустимо перекрёстное использование посуды и наконечников для работы с разными хромогенами. Исключить воздействие прямого солнечного света. Исключить воздействие прямого солнечного света.

27 ИНКУБАЦИЯ С РАСТВОРОМ ХРОМОГЕНА Исключить воздействие света. Исключить воздействие света. Соответствие температуры инкубации требованиям (18-25°С). Соответствие температуры инкубации требованиям (18-25°С). Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Строгое соблюдение продолжительности инкубации. Визуальный контроль характера окрашивания раствора в лунках (неравномерное окрашивание, появление окрашенных капель на стенках лунок – результат некачественной работы). Визуальный контроль характера окрашивания раствора в лунках (неравномерное окрашивание, появление окрашенных капель на стенках лунок – результат некачественной работы).

28 ОСТАНОВКА РЕАКЦИИ При внесении стоп-реагента необходимо добиваться полного перемешивания растворов (не пипетированием)

29 УЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ Исправный, поверенный спектрофотометр. Исправный, поверенный спектрофотометр. Предварительный прогрев прибора. Предварительный прогрев прибора. Сопоставить визуальную оценку планшета с распечаткой. Причиной повышенной ОП могут быть: загрязнение дна лунки, дефект пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра. Сопоставить визуальную оценку планшета с распечаткой. Причиной повышенной ОП могут быть: загрязнение дна лунки, дефект пластика, посторонние включения в растворе, загрязнение линзы спектрофотометра. Исключить влияние артефактов позволяет измерение ОП относительно фильтра 620 нм Исключить влияние артефактов позволяет измерение ОП относительно фильтра 620 нм

30 ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Оценить соответствие полученных контрольных значений ОП требованиям, заложенным в инструкции по применению (валидность теста). Оценить соответствие полученных контрольных значений ОП требованиям, заложенным в инструкции по применению (валидность теста). Сопоставить полученные контрольные значения ОП с паспортными (при правильно проведённом анализе не должно быть существенных отличий). Сопоставить полученные контрольные значения ОП с паспортными (при правильно проведённом анализе не должно быть существенных отличий).

31 ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ТЕСТ- СИСТЕМЫ При определении антигена — минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест- системой. При определении антигена — минимальная концентрация вещества, определяемая данной тест- системой. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела. При определении антител – процент образцов, давших положительный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, содержащих выявляемые антитела. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ТЕСТ-СИСТЕМЫ Процент образцов, давших отрицательный результат в данной тест-системе, от общего количества обследованных образцов, действительно не содержащих выявляемый маркёр.

32 Возможные причины занижения чувствительности анализа Уменьшение времени инкубации (как правило, субстратной реакции). Уменьшение времени инкубации (как правило, субстратной реакции). Использование загрязнённой посуды и наконечников. Использование загрязнённой посуды и наконечников. Замачивание посуды и наконечников в перекиси водорода или хлорсодержащих растворах без последующего кипячения в процессе мытья. Замачивание посуды и наконечников в перекиси водорода или хлорсодержащих растворах без последующего кипячения в процессе мытья. Обработка рабочих поверхностей, пипеток, перчаток в процессе работы перекисью водорода или хлорсодержащими растворами. Обработка рабочих поверхностей, пипеток, перчаток в процессе работы перекисью водорода или хлорсодержащими растворами. Плохая отмывка после инкубации сывороток в тестах, выявляющих антитела. Плохая отмывка после инкубации сывороток в тестах, выявляющих антитела. Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры. Растворы, не нагретые перед постановкой до комнатной температуры. Размещение планшетов в термостате стопкой. Размещение планшетов в термостате стопкой. Низкая температура в лабораторных комнатах. Низкая температура в лабораторных комнатах. Нарушение правил и сроков хранения вскрытых компонентов при дробном использовании набора. Нарушение правил и сроков хранения вскрытых компонентов при дробном использовании набора.

33 Возможные причины снижения специфичности анализа Контаминированный вошер или низкого качества дистиллированная вода. Контаминированный вошер или низкого качества дистиллированная вода. Плохая отмывка на стадии конъюгата. Плохая отмывка на стадии конъюгата. Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации. Длительное внесение образцов по отношению к времени инкубации. Неправильная работа с пипетками (контаминация пипетки, неправильное дозирование). Неправильная работа с пипетками (контаминация пипетки, неправильное дозирование). Неправильное использование влажной камеры, липкой пленки, приводящее к подсыханию раствора. Неправильное использование влажной камеры, липкой пленки, приводящее к подсыханию раствора. Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ). Многократное использование наконечников и посуды для субстратного раствора (ТМБ). Нерастворенные кристаллы в концентрате отмывающего раствора. Нерастворенные кристаллы в концентрате отмывающего раствора. Заросшие или с наличием клеточных элементов сыворотки. Заросшие или с наличием клеточных элементов сыворотки. Неисправный планшетный спектрофотометр. Неисправный планшетный спектрофотометр.

источник

Методика иммуноферментного анализа применяется в различных отраслях медицины. Но в большинстве случаев данным методом диагностируют широкий круг инфекционных заболеваний, таких как вирус иммунодефицита человека, гепатит, герпес и прочих инфекций половых органов. Также иммуноферментный анализ применяют для выявления онкомаркеров различного происхождения, определения гормонов и при диагностике репродуктивной функции организма. Материалом для иммуноферментного исследования является кровь человека.

Иммуноферментный анализ крови – это лабораторное иммунологическое исследование крови, при котором происходят качественные и количественные измерения антител (антигенов), а также гормонов. Этот метод предоставляет до 90% точности при установлении диагноза заболевания.

Медицинские лаборатории используют несколько вариантов его проведения, что влияет на срок готовности результатов. Но в среднем выдача результатов исследования происходит в период 1-10 дней после сдачи крови.

При данном виде анализа крови устанавливаются антитела разных видов – это иммуноглобулины класса M, A, G (JgM, JgA, JgG). Их накопление происходит в различные временные промежутки. Первыми начинают проявляться иммуноглобулины класса М (пятый день после начала болезни). Такие иммуноглобулины задерживаются в организме пять-шесть недель, после чего начинают исчезать из крови организма. Именно в данный период времени выявляются антитела класса М.

Вторыми проявляются иммуноглобулины класса G (через три-четыре недели). Они задерживаются в организме несколько месяцев или лет. Во время проведения иммуноферментного анализа крови и расшифровки его результата можно обнаружить возрастание антител класса G. Это свидетельствует о наличии инфекции или реинфекции.

Антитела класса А проявляются в крови на протяжении двух-четырех недель. Но всего лишь 20% из них присутствуют в сыворотке крови. Остальные же входят в состав секрета слизистых оболочек. Иммуноглобулины класса А начинают исчезать в промежутке времени от двух недель до двух месяцев. Данный процесс является свидетельством уничтожения инфекции в организме. Если после выздоровления человека проводился повторный иммуноферментный анализ крови и расшифровка результата показала наличие антител класса А – это свидетельство хронической инфекции.

Расшифровка результатов анализа может принимать такие значения:

  • JgM (-), JgG (-), JgA (-) – отсутствие иммунитета к инфекции;
  • JgM (-), JgG (+), JgA (-) – наличие поствакционного или постинфекционного иммунитета;
  • JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) – наличие острой инфекции;
  • JgM (+), JgG (+), JgA (+) – наличие обострения хронической инфекции;
  • JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) – наличие хронической инфекции;
  • JgM (-) – выздоровление.

В расшифровке (+) является положительным результатом, а (–) – отрицательным результатом.

Помимо уточнения классов антител в расшифровке встречаются количественные их показатели. Но обширное их объяснение может предоставить только лечащий врач.

Сыворотка крови – это прозрачная жидкость с желтым оттенком. После свертывания крови она отделяется от кровяного сгустка. Не содержит фибрина и форменных элементов.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови основан на взаимодействии антигена с антителом, причем один из них содержит в своей структуре фермент. При взаимодействии двух компонентов содержимое пробирки должно менять свой цвет. Результаты сравниваются со стандартной цветовой шкалой, и далее устанавливается антиген, который присутствует в материале. Другими словами принцип иммуноферментного анализа сыворотки крови можно объяснить так:

  1. подготавливаются наборы антигенов (например, возбудители инфекционных заболеваний, аллергены или гормоны);
  2. пациент сдает кровь на анализ, из которой в лаборатории выделяется сыворотка;
  3. материал для исследования добавляется в лунки готовых наборов, после чего возникает реакция антиген-антитело;
  4. оставшаяся сыворотка крови убирается, а обнаруженные антитела распознаются при помощи индикаторов.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови считается достоверным. Но в тех случаях, когда произошло неправильное взятие крови для анализа, или была нарушена техника проведения исследования, или же имеются у человека скрытые системные заболевания, результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови могут оказаться ложными.

Иммуноферментный анализ сыворотки крови исследует практически все гормоны щитовидной железы, онкомаркеры и различные виды инфекций.

К гормонам щитовидной железы относятся тиреоглобулин (ТГ), тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3), свободный тироксин (Т4), свободный трийодтиронин (Т3).

Иммуноферментный анализ крови в норме считается, если присущи такие допустимые нормы гормонов щитовидной железы:

  • тиреоглобулин (ТГ) – допустимые границы 70 МЕ/мл;
  • тироксин (Т4) – 64-146 нмоль/л (50-113 нг/мл);
  • трийодтиронин (Т3) – 1,8-2,8 нмоль/л (0,8-2,0 нг/мл);
  • свободный тироксин (Т4) – 11-25 пмоль/л (10-27 пг/мл);
  • свободный трийодтиронин (Т3) – 4,49-9,3 пмоль/л (2,5-5,8 пг/мл).

В случае исследования половых гормонов иммуноферментный анализ крови в нормедля женщин считается, если в организме выделяется лютеинизирующий гормон (ЛГ) в таких пределах:

  • фолликулярная фаза цикла (с первого дня месячных до двенадцатого-четырнадцатого) – 2-14 мЕд/л;
  • овуляционная фаза цикла (с двенадцатого дня по четырнадцатый день) – 24-150 мЕд/л;
  • лютеиновая фаза цикла (с пятнадцатого-шестнадцатого дня и до начала следующих месячных) – 2-17 мЕд/л.

В норме для мужчин принимается, если половой гормон вырабатывается в пределах 0,5-10 мЕд/л.

При исследовании хронического гонадотропина (ХГ) референсные значения зависят от пола человека.

  • У взрослых мужчин и небеременных женщин нормой считается уровень ХГ ниже 5мЕд/мл.
  • У беременных женщин результат зависит от срока беременности и может колебаться в пределах 25-49000 мЕд/мл.

Иммуноферментный анализ крови исследует множество онкологических показателей. К ним можно отнести наличие пролактина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, стероид связывающего глобулина (ССГ) и других маркеров. Но интерпретация результата анализа и норм этих показателей должна проводиться только лечащим врачом.

Кроме того, данный метод диагностирует инфекционные (например, краснуха, корь, туберкулез, герпес, сифилис, гепатит, псевдотуберкулез) и аутоиммунные заболевания разного вида, а также устанавливает иммунный статус человека. Но все показатели и полученные результаты должны расшифровываться квалифицированным специалистом.

источник

Посмотреть и скачать бесплатно презентацию по теме «Иммунологические реакции». pptCloud.ru — каталог презентаций для детей, школьников (уроков) и студентов.

Кафедра микробиологии и вирусологии фгбоу ВО ТГМУ 2016г

1. Серологические реакции, которые используются для серологической диагностики. 2.Серологические реакции, которые используются для серологической идентификации. 3.Современные методы Иммунологических исследований при инфекционных болезнях: (Иммунолюминесцентный и Иммуноферментный анализ, генодиагностика, полимеразная цепная реакция). 4.Серологические реакции, которые используются в вирусологии.

для выявления антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов – для серологической диагностики инфекционной болезни; для определения неизвестных антигенов (бактерий, грибов, вирусов) за известными стандартными сыворотками-антителами – для серологической идентификации возбудителей.

Иммунные реакции подразделяются на простые и сложные. Для их постановки необходимы основные два компонента: антиген и антитело. К простым реакциям, применяемым для диагностики, относятся реакции агглютинации, реакции преципитации, реакции нейтрализации. К сложным реакциям – иммунофлюоресцентный метод, радиоиммунный метод, иммуноферментный метод, иммунолюминесцентный метод исследования, метод иммуноблотинга.

Реакция агглютинации (agglutinacio — склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсор­бированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фа­зе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, Во второй — образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия).

Агглютинат может быть двух типов — мелкозернистый и крупнохлопчатый. Мелкозернистый – это результат взаимодействия мелких бактерий, крупнохлопчатый– бактерий, имеющих жгутики.

Все реакции агглютинации подразделяются на два типа: ориентировочные (ОРА), которые выполняются на стекле, развернутые (РРА) – выполняются в пробирках с титрованием сыворотки.

Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции..

Ориентировочные реакции также могут иметь две цели: Идентификация микробного вида (с использованием известной иммунной сыворотки). Поиск антител в сыворотке крови пациента с использованием известного микробного диагностикума.

ОРА — ориентировочной реакции агглютинации

Этапы выполнения реакции: На обезжиренное стекло нанести каплю физиологического раствора. Внести петлей исследуемую культуру бактерий, равномерно распределить в капле физиологического раствора Добавить каплю специфической агглютинирующей иммунной сыворотки Учесть результат реакции. Положительной считается реакция, когда в капле происходит просветление жидкости и формирование агглютината.

модификацииРеакция агглютинации : это реакция Минкевича и реакция Хеддельсона.

Реакция Минкевичапозволяет определить наличие противотуляремийных антител у инфицированного пациента. Необходимые ингредиенты: Капля крови пациента, взятая при помощи скарификатора из пальца больного Дистиллированная вода Туляремийныйдиагностикум.

На обезжиренное стекло нанести каплю крови пациента Добавить каплю дистиллированной воды для лизиса эритроцитов Внести каплю туляремийногодиагностикума Учесть результаты. Положительной считается реакция, если в капле образуются зерна агглютината.

Реакция Хеддельсонапозволяет не только выявить антитела в сыворотке инфицированного бруцеллезом пациента, но и определить титр антител. Необходимые ингредиенты: Сыворотка пациента Физиологический раствор Бруцеллезный диагностикум

основан на использовании большого стекла фотопластины, концентрированной неразведённой сыворотки крови больного в нарастающих или уменьшающихся объёмах, дополняемой до определённого уровня физиологическим раствором, что приравнивается к разным разведениям, и окрашенного метиленовым синим диагностикума для лучшей видимости образующегося агглютината. Ускорение реакции достигается смешиванием ингредиентов путём лёгкого покачивания стекла и помещения его в термостат при +37Сº. На одном стекле одновременно проводят анализ сывороток от нескольких больных. Результат получают через 2-5 минут в виде голубого агглютината разной активности в зависимости от разведений.

реакцию адсорбции агглютининов по Кастелланиприменяют для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара:

Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо­вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти­тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию.

Принцип метода: Перекрёстная РА направлена на извлечение групповых антител методом адсорбции специфический антиген (АГ) изымает из сыворотки все антитела — и специфические только для него, и групповые; неспецифический АГ — только групповые. В данной реакции наряду со специфическим антигеном используют родственные гетерологические АГ. Например, у больного брюшным тифом (Т) сыворотка крови дала агглютинацию со специфическим диагностикумом Т и с групповым паратифа А.

Реакция агглютинации латекса (РАЛ) экспресс-метод выявления антигенов и антител(ориентировачный вариант)

Для постановки РАЛ используют сенсибилизованные частицы полистиролового латекса диаметром 0,5-1,2 мкм, которые в присутствии гомологичного иммунологического реагента (антигена или антитела) склеиваются. Эта реакция происходит достаточно быстро – на протяжении 2-7 мин. Нагруженные антителами частицы латекса широко используются для выявления антигенов вирусов и бактерий. Нагружая латекс антигенами, можно определять наличие антител в сыворотке больного. Такую модификацию РАЛ используют для выявления противогриппозных, противокраснушных, протикоревых антител и т.д.

Для постановки КОА используют золотистые стафилококки (штамм Cowan 1). В клеточной стенке этих микроорганизмов содержится белок А, который имеет значительное родство к Fc фрагменту IgG человека и кролика. Поэтому молекулы IgG после адсорбции на стафилококках, которые имеют белок А, ориентированные в окружающую среду своими свободными Fab фрагментами, в которых находится активный центр антитела.

Реакцию ставят на стеклянных пластинках, смешивая одинаковые объемы (1-2 капли) исследуемого материала (кровь, моча, слюна, фильтраты фекалий и др.) и стафилококкового диагностикума. Смесь тщательно перемешивают и через 2-5 мин. на тёмном фоне должна четко будет просматриваться мелкозернистая агглютинация стафилококков.

РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ (ПАССИВНОЙ) ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ наиболее из чувствительных серологических реакций

Основана на способности антител взаимодействовать с антигеном, фиксированным на различных эритроцитах, которые при этом агглютинируют. Для постановки этой реакции необходимо приготовление эритроцитарногодиагностикума. Эритроцитарныйдиагностикум может быть двух видов: антигенный и антительный.

Необходимые ингредиенты: Сыворотка крови инфицированного пациента Физиологический раствор Эритроцитарныйдиагностикум Реакция пассивной гемагглютинации выполняется в лунках иммунологического планшета. В лунки планшета внести физиологический раствор в одинаковом количестве -0,25 мл для разведения сыворотки В первую лунку внести сыворотку крови пациента, разведенную в 50 раз в объеме 0,25 мл; перемешать содержимое пипеткой и этой же пипеткой набрать 0,25 мл и перенести в следующую лунку Перемешать содержимое и повторить эту процедуру во всех лунках, предназначенных для проведения реакции. Приготовить контроль, для чего в одну лунку внести 0,25 мл физиологического раствора Во все лунки, включая контрольную, внести по 2 капли приготовленного эритроцитарногодиагностикума и перемешать путем осторожного покачивания планшета.

Положительной считается проба, когда в лунках планшета на дне в контроле эритроциты ложатся в виде «пуговки», а в опытных лунках появляется осадок в виде «зонтика». Схема постановки и учета РПГА

Развернутые реакции агглютинации предложены для поиска антител в сыворотках крови инфицированных пациентов при некоторых бактериальных инфекциях. При этом применяются диагностикумы, приготовленные из микроорганизмов. Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

Для выполнения этих реакций необходимо предварительное титрование сыворотки.

Разведение 1:10 это 1мл сыворотки + 9 мл физ. раствора 1:50 это 1 мл сыворотки + 49 мл физ. раствора или 1:50 это 0,1 мл сыворотки + 4,9 мл физ. раствора 1:100 это 1 мл сыворотки + 99 мл физ. раствора или 1:100 это 0,1 мл сыворотки +9,9 мл физ. раствора. В 10 пробирок вносим по 2,5 мл физиологического раствора. 8 пробирок будут опытными, 2 – контрольными: контроль сыворотки и контроль антигена. В контроль сыворотки вносим только разведенную сыворотку в объеме 2,5 мл, в контроль антигена — только взвесь диагностикума.

Затем во все пробирки, кроме контроля сыворотки, вносим по 1 мл взвеси диагностикума. В результате образования агглютината мутная жидкость в пробирках просветляется, на дно оседает осадок агглютината. Учет реакции начинается с контрольных проб: в контроле сыворотки должна быть прозрачная сыворотка, в контроле антигена- равномерно мутная взвесь диагностикума. Титр РРА учитывается по разведению сыворотки, в которой еще явственно видно формирование осадка агглютината.

СХЕМА ПОСТАНОВКИ РАЗВЁРНУТОЙ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ С СЫВОРОТКОЙ БОЛЬНОГО ПО ВИДАЛЮ (РАЙТУ)

Реакция преципитации отличается от агглютинации по характеру антигенов:

В реакции агглютинации они корпускулярные, даже целые клетки, а в реакции преципитации – молекулярные, в растворимом состоянии. Антигенами могут быть экстракты микроорганизмов, тканей, органов, химические вещества. Феномен преципитации заключается в том, что антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами (преципитиногенами), предопределяют образование осадка (преципитата) или помутнения раствора. За титр реакции принимают наибольшее разведение антигена, которое дает положительный результат.

Феномен преципитации широко используется в микробиологической практике:

В судебно-медицинской экспертизе его применяют для определения видовой принадлежности крови: можно установить, какому виду принадлежит выявленная кровь. Определяют возможную фальсификацию продуктов (мясо, мед).Для диагностики эпидемического цереброспинального менингита, чумы, дизентерии, определения инфицированности возбудителем сибирской язвы продуктов и материалов животного происхождения (кожа, мех, щетина). Реакцию Ухтерлони используют для определения антигенного состава органов и тканей, как нормальных, так и опухолевых, количества антигенов в сложных системах. Она имеет важное значение в диагностике дифтерии, оспы и других заболеваний.

Реакция микропреципитации на примере экспресс-диагностики сифилиса (ЭДС).

Данная реакция выполняется для скрининга сывороток при массовых обследованиях на сифилис. В качестве антител применяются сыворотки крови пациентов, антигеном служит кардиолипиновый антиген (неспецифический). Реакция выполняется в лунках иммунологического планшета. Необходимо иметь два контроля: в первом в качестве ингредиентов применяется физиологический раствор и кардиолипиновый антиген (контроль мутности), во втором контроле – заведомо положительная сыворотка и кардиолипиновый антиген (контроль преципитата). В опытной лунке – изучаемая сыворотка больного, взятая в разведении 1:10 и кардиолипиновый антиген. После смешивания реагентов в течение 2-5 минут осторожно покачиваем планшет, в течение этого времени формируется преципитат, жидкость в лунке становится прозрачной. Учет реакции ведется по четырех плюсовой системе. Результат, оцениваемый как один и два плюса считается сомнительным, на 3 и 4 ++++ — положительным. Схема реакции микропреципитации представлена на рис. 10.

Методика определения количества иммуноглобулиновв сыворотке крови (реакция Манчини)

Метод простой линейной иммунодиффузии основан на взаимодействии антисыворотки, содержащейся в геле агар-агара с раствором антигена образуют линии и полосы преципитации. Судя по ширине зон преципитации в тесте простой радиальной диффузии, можно проводить количественное определение антигенов. Взаимное рас­положение линий преципитации в тестах двойной и встречной иммунодиффузиипозволяет оценивать иммунохимическое сходство или различие антигенных компонентов. Методы иммунодиффузии характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстрак­ты различных органов и т. д.

Метод объединяет реакцию преципитации в геле с электрофорезом. Для этого слой агара наносят на предметное стекло, на его разных краях вырезают две лунки, а в центре – разделяющую канавку. В лунки вносят смесь антигенов и проводят электрофорез в течение 1-2 часов. Различные антигены с разной скоростью перемещаются между катодом и анодом. Затем в канавку вносят преципитирующую сыворотку и через 5-7 суток в геле образуются зоны преципитации. Для лучшей визуализации агар окрашивают красителями (например, амидо черным).

источник



Источник: art-mylife.ru


Добавить комментарий