Цитохимия анализ крови что это такое

Цитохимия анализ крови что это такое

Цитохимический анализ — это исследование функциональной активности ферментов, участвующих в энергетическом обмене клеток человеческого организма.

Исследование проводится в лимфоцитах периферической крови.

Кровь для цитохимической экспертизы берется из пальца, как для «обычного» общего анализа крови.

Любое заболевание или неблагоприятное внешнее воздействие приводит к изменению биохимических процессов в клетках тканей человека. Изменяется степень активности внутриклеточных ферментов, а так же соотношение активности разных ферментов внутри одной клетки. Современные технологии позволяют объективно оценить отклонения в функциональной активности внутриклеточных ферментов и нормализовать энергетический обмен клетки, целенаправленно и индивидуально назначив пациенту недостающие элементы (витамины и витаминоподобные вещества). Это и есть метаболитная терапия .

В результате проводимых в течение 30 лет исследований в области цитохимии выявлены возрастные и сезонные изменения функциональной активности ферментных систем клеток человеческого организма. Это позволило создать программу, с помощью которой возможно прогнозировать периоды снижения устойчивости организма к неблагоприятным внешним воздействиям (стресс, переезды, прививки, острые вирусные заболевания и т.д.). Такой прогноз позволяет принять профилактические меры по метаболитной поддержке пациента в эти периоды.

Метаболитная терапия, регулируя энергетический обмен в клеточных структурах организма, способствует повышению его устойчивости к внешним воздействиям, а значит, уменьшает тяжесть течения хронических заболеваний, снижая вероятность из обострения, ускоряет выздоровление при острых заболеваниях. В результате регулярно проводимых курсов метаболитной терапии, особенно в сочетании с рациональной диетой, снижается частота заболеваний у группы так называемых «часто болеющих детей».
Кроме того, необходимо принимать во внимание следующие соображения. Ткани организма детей с хроническими часто рецидивирующими заболеваниями, как правило, находятся в состоянии гипоксии, то есть усвоение кислорода в клетках организма нарушено. Это приводит не только к усугублению обменных нарушений, но и к ослаблению лечебного действия медикаментов, назначаемых для лечения основного заболевания. «Задыхающаяся» клетка недоступна для воздействия лекарственного вещества. А это приводит к необходимости повышения доз лекарств для достижения клинического эффекта. Метаболитная терапия — это один из наиболее действенных путей «разблокирования» клеточного обмена, что позволяет разорвать порочный круг: «обострение хронического заболевания — усугубление тканевой гипоксии — слабая положительная реакция на правильно подобранную терапию — утяжеление течения заболевания — усиление тканевой гипоксии».
Использование цитохимической экспертизы и прогнозирование периодов снижения устойчивости организма к внешним воздействиям позволяет составлять индивидуальный график вакцинации ребенка с целью свести к минимуму риск побочных эффектов, а также готовить организм ребенка к вакцинации, своевременно проводя курс метаболитной терапии. Таким образом, проведение метаболитной терапии является необходимым дополнением к лечению любого заболевания, а так же действенным средством профилактики.

По результатам исследования функциональной активности ферментов лимфоцитов периферической крови и с учетом возраста, пола и веса пациента, выдается заключение о состоянии энергетического обмена, прогноз изменения адаптационных возможностей организма на ближайшие полгода и индивидуально составленный перечень витаминов и витаминоподобных веществ для метаболитной терапии. Метаболитная терапия проводится, как правило, 10 дней каждого месяца в течение 3-4 месяцев, затем необходимо повторить анализ для коррекции курса.

Мария Ивановна Холопова
педиатр, гомеопат

запишитесь на прием к детскому врачу
по телефонам (495) 258-257-0, 723-4993

источник

Забор анализов у ребенка может быть сделан медицинским работником на дому или в процедурном кабинете нашего детского медицинского центра.

Сотрудничество с ведущими лабораториями города Москвы позволяет производить широкий спектр лабораторных исследований. Это биохимические и клинические анализы крови и мочи, коагулограмма, кардиомаркеры, диагностика анемий, крови на иммунологию, маркеры аутоиммунных заболеваний, онкомаркеры, гормоны, инфекции, лекарственный мониторинг, аллергология, ПЦР-диагностика, исследования кала на дисбактериоз, кишечную группу, копрологию, углеводы, яйца глист, проводятся посевы различных материалов на флору и чувствительность к антибиотикам.

Созданы все условия для проведения забора анализов у детей (кровь из вены, пальца, мазки…), как в поликлинических условиях процедурного кабинета, так и в домашней обстановке. Квалифицированные медицинские сестры обучены специфике забора анализов у детей , поэтому данная процедура не станет моральной травмой для вашего ребенка.

Совместно с лабораторией цитохимии научного центра детского здоровья РАМН используются программы цитохимической экспертизы качества жизни и прогностического сценария развития будущего ребенка, в основу которых положен цитохимический анализ лейкоцитов периферической крови. Этот высокоинформационный метод отражает состояние ферментного статуса клеток мозга, миокарда, печени, почек, селезенки, тимуса, мышц слизистой желудка и кишки (опосредованная биопсия); позволяет прогнозировать исход экспериментальной, бактериальной и вирусной инфекции; интоксикации, аллергической реакции и вакцинации.

Программа цитохимической экспертизы качества жизни позволяет оценить уровень состояния здоровья пациентов разного возраста и пола: биологический возраст, состояние энергетического обмена, психических функций, творческих способностей, показатели жизнестойкости.

Получить всю необходимую информацию, а также записаться на анализы Вы можете по телефону 8 (495) 374-79-43 .

Анализы. Общие исследования крови
Анализ крови на содержание сахара(экспрес) 200
Время кровотечения 200
Время свертываемости 200
Гематокрит 200
Гемоглобин 200
Исследование на мононуклеары 300
Общий анализ крови (клинический- L, Hb, СОЭ) 300
Общий анализ крови (клинический- L,L-форм., Hb, Э, СОЭ) 500
Общий анализ крови(L,L-форм.,Hb,Э,СОЭ,тромб.,ретик.,цв.пок. ) 750
Определение группы крови 300
Определение резус-фактора 300
Резус — антитела 500
Ретикулоциты 200
Содержание гемоглобина в эритроците(цв. показ) 200
СОЭ 150
Тромбоциты 200
Коагулограмма стандартн. (11 показ.) 750
Цитохимический анализ крови 1800

Вопрос:
Добрый день! Вчера были на приеме. Дадыка Александра.сдали кровь и мочу. По моче все показатели в норме. Кровь: средний объём эритроцитов 71,7, эозинофилы 0,43, моноциты 9,8,моноциты # 0,93. Остальные показатели в норме. Можете дать рецензию?

Ответ:
Добрый день! Клинический анализ крови без значимых отклонений.

Задать вопрос и получить ответ можно здесь.

источник

Цитохимическое исследование крови применяются для определения наличия или отсутствия определенных веществ в клетках. Наиболее часто для анализа используют лейкоциты с целью определения вида лейкоза. Каждый вид рака крови имеет определенный, характерный только для него продукт обмена, который и находят при цитохимическом анализе крови.

Невозможно поставить диагноз ракового заболевания крови без проведения данных анализов, без которых современные гематологические исследования будут не полными.

Далее перечислены наиболее распространенные цитохимические анализы. Все перечислить невозможно, да и не нужно – их сотни, ведь применение их в практике врача очень узкое.

  • щелочная фосфатаза
  • кислая фосфатаза
  • миелопероксидаза
  • реакция на железо
  • реакция с суданом черным
  • PAS реакция (или ШИК-реакция)
  • неспецифическая кислая эстераза
  • специфическая эстераза

Щелочная фосфатаза в лейкоцитах – фермент присутствует в цитоплазме только зрелых нейтрофилов, в меньшем количестве в палочкоядерных. Позитивность оценивается по степени окраски нейтрофилов от 0 до 4 при подсчете в 100 клетках. В норме показатель колеблется от 20 до 80. Снижение щелочной фосфатазы в лейкоцитах аж до 0 происходит при хроническом миелолейкозе, а повышение при всех заболеваниях миелопролиферативного синдрома (миелофиброз, полицитемия, первичная тромбоцитопения) и беременности. Не стоит путать локализированную в лейкоцитах щелочную фосфатазу с щелочной фосфатазой из печени и костей.

Кислая фосфатаза – повышается при всех хронических и острых Т-лимфопролиферативных заболеваниях. При болезнях В-лимфоцитов реакция слабая или отрицательная. Исключение – волосяноклеточный лейкоз, его клетки содержат изоэнзим 5 кислой фосфатазы который невозможно заблокировать тартратом, что характерно для данного заболевания.

Миелопероксидаза – фермент характерен для миелоидного ряда гранулоцитов – нейтрофилов, эозинофилов, базофилов. Анализ важен для дифференциации острых миелоидных и лимфоидных лейкозов.

Реакция на железо (реакция Перлса, реакция с прусской лазурью) — данным методом определяется наличие железа в эритробластах (сидеробластах) и макрофагах костного мозга (сидерофагах). При сидеробластической анемии гранулы расположены в форме венца вокруг и митохондрий. Читайте о диагностике анемии в статье «Диагностика анемии. Какие анализы стоит сдавать?». При сидеропенической анемии никаких гранул не выявляют вообще, а количество сидеробластов ниже 10%. Данным методом можно окрасить и осадок мочи для выявления гемосидеринурии при пароксизмальной ночной гемоглобинурии.

Судан черный В – применяют для выявления принадлежности лейкоцитов к гранулоцитарному ряду – к нейтрофилам, эозинофилам, базофилам. У моноцитов положительность реакции значительно ниже.

PAS реакция – применяется для выявления гликогена и полисахаридных скоплений. PAS реакция положительна при ряде доброкачественных и злокачественных лимфопролиферативных заболеваний. Диагностируют таким способом острый лимфолейкоз, который по прогнозу и лечению отличается от остальных видов острого лейкоза. PAS реакция положительна при эритремии.

Кислая неспецифическая и специфическая эстераза – анализы проводятся для дифференциации моноцитарных и лимфоцитарных заболеваний крови.

источник

Цитохимия является одним из разделов цитологии. В переводе с греческого цитология — это наука о клетке («цитос» — клетка, «логос» — наука). Она изучает строение и функции клеток, их взаимосвязь и отношения в органах и тканях. Исследования клетки имеют большое значение для профилактики возможных заболеваний. Ведь именно в клетках начинают развиваться патологические изменения, приводящие к их возникновению.
Говоря простым языком, клетки — это маленькие кирпичики, из которых строится наш организм. Как прочное здание нельзя построить из плохих кирпичей, так и здоровье всего организма зависит от состояния каждой клеточки. Используя при закладке фундамента хотя бы один бракованный кирпичик, вы ставите под угрозу прочность будущей постройки. От состояния клеток родителей зависит здоровье их будущих детей и даже внуков.
Цитохимические прогнозы основываются на том, что любое заболевание или неблагоприятное внешнее воздействие приводит к изменению биохимических процессов в клетках. Цитохимический анализ — это исследование функциональной активности ферментов, участвующих в энергетическом обмене клеток человеческого организма. Для проведения этого анализа достаточно нескольких капелек крови из пальца.
После проведения исследования врач консультирует пациента по результатам анализа и назначает необходимую терапию. Цитохимия крови позволяет врачу обнаружить еще скрытые проблемы и назначить необходимое лечение до возникновения первых симптомов заболевания и принять необходимые терапевтические меры для профилактики его развития. Современные технологии позволяют объективно оценить отклонения в функциональной активности внутриклеточных ферментов и нормализовать энергетический обмен клетки, целенаправленно и индивидуально назначив пациенту недостающие элементы.

преждевременного отхождения околоплодных вод,
риска рождения недоношенного ребенка,
оценки новорожденного по шкале Апгар,
развития инфекционной патологии у младенца,
продолжительности лактации,
возраста появления первых признаков аллергического диатеза,
уровня психомоторного развития доношенного ребенка к 6 месяцам и к году,
частоты заболеваемости респираторными инфекциями доношенного ребенка к 6 месяцам, к году и к 2-м годам,
развития речевой функции малыша к году,
неврозоподобных состояний у детей раннего возраста,
адаптации к детскому коллективу детей в возрасте от 1,5 до 3 лет

На основании анализа крови проводится цитохимическая экспертиза, которая оценивает здоровье человека на клеточном уровне. Благодаря ей можно узнать биологический возраст клетки, состояние энергетического обмена, психических функций, творческих способностей, показателей жизнестойкости.
При наличии заболевания цитохимия позволяет определить фазу его течения и спрогнозировать его дальнейшее развитие. Кроме того, изучение клеток крови в период проведения лекарственной терапии позволяет оценить эффективность проводимого лечения, чувствительность к лекарственным препаратам. Кроме того, имея подобного рода информацию, можно свести к минимуму дозы лекарственных препаратов. Так, при хронических заболеваниях ткани организма, как правило, находятся в состоянии гипоксии, то есть усвоение кислорода в клетках организма нарушено. Это приводит не только к нарушению обменных процессов, но и к ослаблению лечебного действия медикаментов, назначаемых для лечения основного заболевания.

Супружеским парам при подготовке к беременности.
Новорожденным детям.
Детям и взрослым с хроническими и острыми заболеваниями с целью определения тяжести состояния.
В период медикаментозной терапии для оценки эффективности проводимого лечения.
При подготовке к различного рода операциям.
При диспансерном обследовании.
Здоровым детям перед проведением профилактических прививок, в «критические периоды» развития, после или во время стрессовых ситуаций, а также перед поступлением в детские дошкольные и школьные учреждения.

В результате проводимых в течение 30 лет исследований в области цитохимии выявлены возрастные и сезонные изменения функциональной активности ферментных систем клеток человеческого организма. Это позволило создать программу, с помощью которой возможно прогнозировать периоды снижения устойчивости организма к таким внешним воздействиям, как стресс, переезды, прививки, острые вирусные заболевания. Эти наблюдения сделали возможным прогнозировать и вероятные периоды «планового» ухудшения здоровья и создать календарь индивидуальной устойчивости к внешним воздействиям. Такой прогноз позволяет принять профилактические меры для поддержки организма тогда, когда он в ней действительно нуждается. Кроме того, такое прогнозирование позволяет составлять индивидуальный график вакцинации ребенка с целью свести к минимуму риск побочных эффектов.
Что касается беременных и тех женщин, кто только задумывается о продолжении рода, цитохимическая экспертиза позволяет составить прогноз развития будущего ребенка от зачатия до. двух лет! По состоянию клеток крови будущей матери и активности в них тех или иных ферментов можно судить о здоровье тканей, органов и организма в целом. Таким образом, вырисовывается достаточно полная и подробная картина беременности и родов, а также некоторых особенностей развития ребенка в первые два года жизни.
Но, что самое приятное, какой бы прогноз ни дала вам цитохимия — он не является приговором. Чем раньше составляется прогноз, тем больше возможностей его скорректировать. Идеальный вариант — проведение цитохимической экспертизы до беременности. Это так называемая «опережающая педиатрия» — врач «видит» ребенка, о котором родители еще только задумались. По показателям цитохимического анализа индивидуально подбираются препараты метаболитной терапии — набор витаминов в активированной форме, в виде свеч, пищевых добавок, внутримышечных инъекций — для улучшения обменных процессов в клетках крови. Такая терапия компенсирует недостатки в здоровье будущих родителей и помогает им подойти к зачатию ребенка в лучшей физической и психологической форме.

Благодарим за помощь в подготовке материала Центр цитохимических исследований

источник

Цитохимические исследования проводят в препаратах (мазках или отпечатках) костного мозга, крови, различных органов и новообразований, пунктатов; они основаны на использовании специфических химических цветных реакций для определения в клетках различных веществ (под действием специально подобранных реактивов происходит окрашивание тех или иных веществ в цитоплазме, а по степени и характеру окраски судят о количестве или активности исследуемых веществ). Цитохимические исследования относительно несложны, но уступают в точности количественному анализу, проводимому с помощью биохимических методов.

При цитохимическом исследовании чаще пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип Астальди, основанный на выявлении различной степени интенсивности специфической окраски. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на 4 группы: с отрицательной реакцией (-), слабоположительной (+), положительной (++) и резко положительной (+++). Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида, дифференцируя их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы. Например, при исследовании активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах из 100 просмотренных клеток в 60 клетках активность фермента не выявлена (-), в 35 — специфическая окраска была слабой (+) и в 5 — более интенсивной (++). Результат определения активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах в таком случае составит (60*0)+(35* 1)+(5*2)=0+35+10=45 ед.

Можно выразить результат в виде среднего цитохимического показателя по L. Kaplow (1955) или среднего цитохимического коэффициента (СЦК). С этой целью также дифференцируют 100 исследуемых клеток по указанной выше системе. Полученный процент клеток в каждой группе умножают на соответствующее данной группе число плюсов. Сумма этих величин, деленная на 100, представляет собой СЦК для одной клетки. В указанном примере СЦК щелочной фосфатазы нейтрофилов равен 0,45.

В тех случаях, когда изучаемые вещества локализуются в клетках в виде единичных гранул (например, активность неспецифической эстеразы в лимфоцитах и др.), результат цитохимической реакции целесообразно выражать в процентах клеток, дающих положительную реакцию.

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнивать распределение исследуемых веществ в разных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при различных патологических состояниях организма, а также в зависимости от течения заболевания, степени его тяжести и в связи с проводимой терапией.

Следует иметь ввиду, что цитохимический метод может быть использован только в качестве дополнения к морфологическому исследованию, но не может его заменить. Недостатком всех цитохимических реакций является их приблизительная качественная оценка, основанная на степени интенсивности окраски.

Наиболее часто проводятся следующие цитохимические исследования:

  • определение гликогена
  • определение липидов
  • определение железа (негемоглобинового)
  • определение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК)
  • определение активности ферментов:
    • миелопероксидазы,
    • щелочной фосфатазы,
    • кислой фосфатазы,
    • цитохромоксидазы,
    • дегидрогеназ
      • сукцинатдегидрогеназы
      • альфа-глицерофосфатдегидрогеназы
    • неспецифических эстераз
      • альфа-нафтилацетат-эстеразы,
      • кислой альфа-нафтилацетат-эстеразы,
      • нафтол-AS-ацетат-эстеразы,
      • нафтол-AS-D-хлорацетат-эстеразы
  • определение катионного белка
  • тест восстановления нитросинего тетразолия.
  • Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е. А. Кост. Москва «Медицина» 1975 г.
  • Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под ред. проф. В. В. Меньшикова Москва «Медицина» 1987 г.

Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов — шифф-йодная кислота).

Раздел: Цитохимия

Миелопероксидаза является лизосомальным ферментом, катализирующим в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. Она локализуется преимущественно в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и является маркером клеток миелоидного ряда. Миелопероксидаза выявляется в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта.

Раздел: Цитохимия

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Для подсчета миелокариоцитов пунктат костного мозга разводят в 200 раз. Для этого к 4 мл 3 -5% раствора уксусной кислоты добавляют 0,02 мл пунктата. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и заполняют камеру Горяева. После оседания форменных элементов (через 1 — 2 мин) подсчитывают миелокариоциты в 100 больших квадратах (аналогично подсчету числа лейкоцитов в периферической крови).

Раздел: Гемоцитология

Неорганизованные осадки мочи состоят из различных солей, органических соединений и лекарственных веществ, осевших в моче в виде кристаллов или аморфных тел. Однако чаще неорганизованный осадок состоит преимущественно из солей.

Раздел: Анализ мочи

источник

Цитохимический анализ — это исследование функциональной активности ферментов, участвующих в энергетическом обмене клеток человеческого организма.

Исследование проводится в лимфоцитах периферической крови.

Кровь для цитохимической экспертизы берется из пальца, как для «обычного» общего анализа крови.

Любое заболевание или неблагоприятное внешнее воздействие приводит к изменению биохимических процессов в клетках тканей человека. Изменяется степень активности внутриклеточных ферментов, а так же соотношение активности разных ферментов внутри одной клетки. Современные технологии позволяют объективно оценить отклонения в функциональной активности внутриклеточных ферментов и нормализовать энергетический обмен клетки, целенаправленно и индивидуально назначив пациенту недостающие элементы (витамины и витаминоподобные вещества). Это и есть метаболитная терапия .

В результате проводимых в течение 30 лет исследований в области цитохимии выявлены возрастные и сезонные изменения функциональной активности ферментных систем клеток человеческого организма. Это позволило создать программу, с помощью которой возможно прогнозировать периоды снижения устойчивости организма к неблагоприятным внешним воздействиям (стресс, переезды, прививки, острые вирусные заболевания и т.д.). Такой прогноз позволяет принять профилактические меры по метаболитной поддержке пациента в эти периоды.

Метаболитная терапия, регулируя энергетический обмен в клеточных структурах организма, способствует повышению его устойчивости к внешним воздействиям, а значит, уменьшает тяжесть течения хронических заболеваний, снижая вероятность из обострения, ускоряет выздоровление при острых заболеваниях. В результате регулярно проводимых курсов метаболитной терапии, особенно в сочетании с рациональной диетой, снижается частота заболеваний у группы так называемых «часто болеющих детей».
Кроме того, необходимо принимать во внимание следующие соображения. Ткани организма детей с хроническими часто рецидивирующими заболеваниями, как правило, находятся в состоянии гипоксии, то есть усвоение кислорода в клетках организма нарушено. Это приводит не только к усугублению обменных нарушений, но и к ослаблению лечебного действия медикаментов, назначаемых для лечения основного заболевания. «Задыхающаяся» клетка недоступна для воздействия лекарственного вещества. А это приводит к необходимости повышения доз лекарств для достижения клинического эффекта. Метаболитная терапия — это один из наиболее действенных путей «разблокирования» клеточного обмена, что позволяет разорвать порочный круг: «обострение хронического заболевания — усугубление тканевой гипоксии — слабая положительная реакция на правильно подобранную терапию — утяжеление течения заболевания — усиление тканевой гипоксии».
Использование цитохимической экспертизы и прогнозирование периодов снижения устойчивости организма к внешним воздействиям позволяет составлять индивидуальный график вакцинации ребенка с целью свести к минимуму риск побочных эффектов, а также готовить организм ребенка к вакцинации, своевременно проводя курс метаболитной терапии. Таким образом, проведение метаболитной терапии является необходимым дополнением к лечению любого заболевания, а так же действенным средством профилактики.

По результатам исследования функциональной активности ферментов лимфоцитов периферической крови и с учетом возраста, пола и веса пациента, выдается заключение о состоянии энергетического обмена, прогноз изменения адаптационных возможностей организма на ближайшие полгода и индивидуально составленный перечень витаминов и витаминоподобных веществ для метаболитной терапии. Метаболитная терапия проводится, как правило, 10 дней каждого месяца в течение 3-4 месяцев, затем необходимо повторить анализ для коррекции курса.

Мария Ивановна Холопова
педиатр, гомеопат

запишитесь на прием к детскому врачу
по телефонам (495) 258-257-0, 723-4993

источник

Цитохимические исследования занимают важное место в дифференциальной диагностике гемобластозов. Кроме большого теоретического значения, неоспорима их роль в уточнении различных форм лейкозов. Разработка эффективных методов дифференциальной диагностики и терапии острых лейкозов, особенно острого лимфобластного лейкоза детей, стала возможной только после введения в клиническую практику цитохимических методов диагностики.

Цитохимические исследования проводят в мазках крови, лейкоконцентрата, костного мозга. Они основаны на использовании специфических химических цветовых реакций для определения в клетках различных веществ. При цитохимическом исследовании пользуются полуколичественной оценкой результатов, используя принцип G. Astaldi (1957), основанный на выявлении специфической окраски различной степени интенсивности. В зависимости от нее исследуемые элементы делят на четыре группы: с отрицательной реакцией (—), слабоположительной (+), положительной (++) и резкоположительной (+++).

Для количественного выражения результатов подсчитывают 100 клеток определенного вида и дифференцируют их по указанному принципу, затем число клеток с одинаковой интенсивностью окраски умножают на соответствующее данной группе число плюсов, сумма этих произведений составляет условные единицы (ед.). Активность ферментов выражают в условных единицах или в виде среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Средний цитохимический коэффициент вычисляют по формуле Кеплоу в модификации Астальди и Верга:

где цифры (1, 2, 3, 4) обозначают интенсивность окраски; буквы (а, б, в, г) — число подсчитанных клеток с определенной интенсивностью окраски (цитохимической реакции).

Метод полуколичественной оценки является ориентировочным, но позволяет сравнить распределение исследуемых веществ в различных клеточных элементах или в одних и тех же клетках при тех или иных патологических состояниях. Следует, однако, иметь в виду, что цитохимический метод может использоваться только в качестве дополнения к другим методам исследования — морфологическим, иммунологическим, цитогенетическим.

За счет гликогена в основном обеспечиваются энергетические потребности клеток. В частности, за счет реакций гликогенолиза образуется энергия, необходимая для осуществления функции фагоцитоза. Локализуется гликоген в цитоплазме клеток. Для цитохимического выявления гликогена чаще всего применяют PAS-реакцию, или ШИК-реакцию (по названию реактива — шифф-йодная кислота).

Положительную ШИК-реакцию могут также давать такие вещества, как гликозаминогликаны, мукополисахариды, гликопротеины, мукопротеи-ны и др. Гликоген можно легко дифференцировать от других веществ пробами со слюной или α-амилазой.

Проба со слюной . Препарат помещают в свежесобранной слюне в термостат при 37 °С на 30 мин, затем его окрашивают вышеописанной методикой. При инкубации препарата αамилаза, содержащаяся в слюне, расщепляет гликоген, и при реакции с реактивом Шиффа розовая окраска на гликоген не развивается’.

Проба с α-амилазой . Препарат помещают в раствор α-амилазы (1 мл профильтрованной амилазы растворяют в 40 мл 0,85% раствора натрия хлорида) на 30 мин в термостат при 37 °С.

Нормальные величины. В мазках периферической крови и костного мозга гликоген содержится в цитоплазме нейтрофилов разной степени зрелости, но преимущественно в более зрелых (в виде обильной мелкой и диффузной зернистости). В цитоплазме мегакариоцитов и тромбоцитов гликоген определяется в виде одиночных крупных зерен. В крови здоровых людей количество интенсивно окрашенных нейтрофилов (+++) колеблется в пределах 2–12 % от общего числа нейтрофилов, средней интенсивности окраски (++) — в пределах 72–90%, слабо окрашенных (+) — от 4 до 18%. СЦК гликогена в нейтрофилах здоровых людей равен 1,71–2,04 (Кост Е. А., 1975), а по данным В. Б. Лецкого (1970) — 2,52. У лиц пожилого и старческого возраста отмечено достоверное снижение СЦК гликогена до 1,98 (Германов В. А., Сергеева Т. М., 1972).

В лимфоцитах здоровых людей гликоген содержится в виде небольшого числа гранул в 10–12% клеток. В мегакариоцитах гликоген обнаруживается в виде гранул (от единичных до 30–50), напоминая скопления кровяных пластинок. Число гликогенположительных мегакариоцитов составляет в среднем 60 % от общего числа мегакариоцитов.

Клиническое значение . Увеличение числа гликогенположительных лимфоцитов4 (до 70–80 %) характерно для лимфопролиферативных заболеваний, особенно для хронического лимфолейкоза (гликоген определяется в виде крупных гранул). Увеличение содержания гликогена в нейтрофилах наблюдается при различных воспалительных процессах, сахарном диабете, истинной полицитемии. Уменьшение отмечается при агранулоцитозах, лучевой болезни, при хроническом миелолейкозе — примерно в 2 раза по сравнению с нормой, особенно при прогрессировании заболевания (общее количество гликогена, определяемое биохимическими методами, может быть даже повышено из-за лейкоцитоза). При тромбоцитопенической пурпуре и симптоматических тромбоцитопениях число гликогенположительных форм мегакариоцитов значительно снижено (после спленэктомии оно восстанавливается до нормальных величин).

В лейкемических клетках при остром миелобластном лейкозе гликоген или не содержится вообще, или распределен диффузно либо в виде мелкой зернистости; при остром лимфобластном лейкозе — в виде крупных гранул, расположенных в цитоплазме вокруг ядра; при остром монобластном лейкозе бластные клетки содержат незначительное количество диффузно окрашиваемого гликогена; при остром эритромиелозе гликоген в виде гранул обнаруживается в эритробластах.

Липиды локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в мембранах органелл и обнаруживаются преимущественно в нейтрофильных гранулоцитах. Играют важную роль в проницаемости мембран. Клетки костного мозга и периферической крови содержат простые липиды в виде нейтральных жиров, свободных жирных кислот, а также сложные липиды — фосфолипиды. Цитохимическое исследование основано на применении веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира применяют судан III, окрашивающий жир в оранжевый цвет. Липоиды лучше выявляются Суданом черным (черное окрашивание). В гематологических исследованиях чаще применяется окраска мазков Суданом III.

Нормальные величины. Липиды содержатся в цитоплазме нейтрофилов в виде обильной зернистости. Большинство нейтрофилов (69–80 %) у здоровых людей окрашивается интенсивно (+++), 18–36 % — дают окраску средней интенсивности (++) и 10 % — слабо окрашены (+). СЦК липидов в нейтрофилах здоровых людей равен 2,65. В меньших количествах липиды в норме обнаруживаются и в моноцитах. В миелобластах обнаружено небольшое количество липидов, в промиелоцитах их больше, и по мере созревания нейтрофилов содержание липидов увеличивается. В клетках лимфатического ряда липиды не выявляются.

Клиническое значение . Повышение СЦК липидов отмечено у лиц старческого возраста. Повышение содержания липидов в нейтрофилах наблюдается при остром миелобластном и монобластном лейкозах, при прогрессировании хронического миелолейкоза. При недифференцированном остром лейкозе бластные клетки содержат липиды в небольшом количестве (2–3 %). Уменьшение СЦК липидов отмечено при лечебном голодании. Снижение содержания липидов в нейтрофилах выявлено при ревматизме, воспалительных процессах. При остром лимфобластном лейкозе липиды в бластных клетках не выявлены.

В организме человека пероксидаза обнаружена в лейкоцитах, тромбоцитах, в молоке, а также в тканях, в которых происходит метаболизм эйкозано-идов. Простетической группой является протогем. В реакции, катализируемой пероксидазой, перекись водорода восстанавливается за счет соединений, выступающих в качестве доноров электронов, таких как аскорбат, хиноны или цитохром С. Реакция, катализируемая пероксидазой, имеет сложный характер и суммарно выглядит следующим образом:

Пероксидаза локализуется преимущественно в специфической зернистости цитоплазмы гранулоцитов, является маркером клеток миелоидной природы. Она отсутствует в лимфоидных клетках. Ввиду специфичности для нейтрофилов, начиная с ранних фаз созревания, фермент получил название миелопероксидаза. Активность пероксидазы подвержена большим колебаниям.

Нормальные величины. В крови здоровых людей активность пероксидазы выявляется преимущественно в цитоплазме гранулоцитов, в меньшей степени и непостоянно — моноцитов. Фермент появляется в клетках на стадиях промиелоцита и более зрелых миелобластов. Лимфобласты не содержат пероксидазу. 3–16% нейтрофилов окрашены резко положительно (+++), 60–90 % — положительно (++), остальные — слабоположительно (+) (Кост Е. А., 1975). СЦК пероксидазы в нейтрофилах здоровых людей равен 2,5 (Лецкий В. Б., 1970). Эозинофилы характеризуются резко положительной реакцией на пероксидазу.

Клиническое значение . В бластных клетках высока активность фермента при остром миелобластном лейкозе. У больных с хроническим миелолейкозом, особенно в терминальной стадии, СЦК снижается до 1,6; слабая активность фермента наблюдается при остром монобластном лейкозе и отсутствует при остром лимфобластном лейкозе. Определение активности миелопероксидазы как маркера миелоидного ряда используется для дифференциальной диагностики острых миелобластных и лимфобластных лейкозов. Снижение активности фермента отмечено при инфаркте миокарда, ревматизме, туберкулезе, опухолях.

Активность щелочной фосфатазы выявляется впервые на стадии метамиелоцита, повышается по мере дифференцировки до сегментоядерного нейтрофила, а затем по мере старения клетки вновь снижается. Активность фермента определяется в специфических гранулах цитоплазмы. Щелочная фосфатаза относится к группе гидролитических ферментов, расщепляет различные фосфорные эфиры в щелочной среде (оптимум pH 9,6), осуществляет гидролиз однозамегценных эфиров ортофосфата. Наиболее распространено определение активности фермента методами азосочетания.

Нормальные величины. У здоровых людей большинство сегментоядерных нейтрофилов являются фосфатазоотрицательными, и только в 20–30 % клеток (Кост Е. А., 1975) (20–40% — по данным Л. В. Козловской и М. А. Мартыновой, 1975) выявлена слабая активность фермента (+). По данным М. Г. Шубина (1980), активность щелочной фосфатазы для здоровых лиц обоего пола составляет 26 ед., т. е. СЦК равен 0,26. Отмечена более высокая активность фермента у женщин по сравнению с мужчинами (соответственно 31,0±0,8 и 21,0±0,7 ед.).

Клиническое значение . Повышение активности фермента в цитоплазме нейтрофилов отмечается при истинной полицитемии, хроническом миелофиброзе, апластических анемиях. Увеличение активности щелочной фосфатазы в цитоплазме нейтрофилов при острых нелимфобластных лейкозах — благоприятный признак, поскольку у таких больных более вероятны ремиссии. Увеличение активности фермента выявлено у детей первого полугодия жизни— 150–159 ед. Активность фермента увеличивается при беременности, при многих воспалительных процессах, хронических заболеваниях печени, инфекциях, злокачественных новообразованиях, диабетическом кетоацидозе, приеме пероральных контрацептивов, болезни Дауна, инфаркте миокарда и др. Резкое снижение активности щелочной фосфатазы (до полного отсутствия) наблюдается при хроническом миелолейкозе, что может служить важным дополнением дифференциальной диагностики хронического миелолейкоза и хронического миелофиброза, а также лейкемоидных реакций по миелоидному типу. Снижение активности фермента наблюдается при вирусных заболеваниях, в том числе инфекционном гепатите, при лучевой болезни, серповидно-клеточной анемии, болезнях соединительной ткани.

Активность кислой фосфатазы обнаруживается преимущественно в нейтрофилах и лимфоцитах крови (максимально в нейтрофильных миелоцитах); локализацию связывают с лизосомами цитоплазмы клеток. Кислая фосфатаза является гидролитическим ферментом (оптимум действия при pH 5,2). Для цитохимического исследования обычно используют методы азосочетания. Нафтолфосфаты под воздействием кислой фосфатазы расщепляются с образованием свободного нафтола, который вступает в реакцию с солью диазония. В результате в местах определяемой активности фермента выпадает осадок азокрасителя красного цвета на зеленом фоне.

Нормальные величины. В клетках крови активность фермента обнаруживается в 12% зрелых гранулоцитов и в лимфоцитах. В нейтрофилах периферической крови здоровых людей активность фермента колеблется в пределах 11–72 ед., т. е. СЦК равен 0,386; в лимфоцитах— 25,0–28,8 ед., т. е. СЦК равен 0,286. У детей активность кислой фосфатазы в нейтрофилах выше, чем у взрослых.

Клиническое значение . Активность кислой фосфатазы повышается при острых лейкозах — монобластном и миелобластном, особенно при остром промиелоцитарном лейкозе (в диффузной форме), при острых лимфобластных лейкозах (в гранулярной форме). Повышение активности фермента наблюдается в нейтрофилах при воспалительных процессах (острая пневмония), туберкулезе, инфаркте миокарда, острых хирургических инфекциях, злокачественных опухолях. Повышение активности фермента в лимфоцитах отмечается при хронических тонзиллитах, при различных аллергических заболеваниях, после иммунизации.

Неспецифические эстеразы — это группа ферментов (гидролаз) с невысокой специфичностью, расщепляющих эфиры карбоновых кислот с короткой углеродной цепью. Локализуются в цитоплазме клеток, главным образом, в лизо-сомах. Активность этих ферментов в той или иной степени выявляется во всех видах лейкоцитов (максимально в незрелых гранулоцитах и моноцитах). Наибольшая активность обнаружена в моноцитах крови. Для определения активности ферментов используют различные субстраты (α-нафтилацетат, нафтол-AS-ацетат, нафтол-AS-D-хлорацетат и др.). Под влиянием неспецифических эстераз из субстрата освобождается свободный нафтол, который дает цветное окрашивание с солями диазония.

Дегидрогеназы — ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов. Ряд из них принимает непосредственное участие в процессах биологического окисления, осуществляя перенос протонов с субстрата, подвергающегося окислению, на другой субстрат. Дегидрогеназы, катализирующие такое восстановление, специфичны как к донору водорода, так и к его акцептору. Дегидрогеназы присутствуют в самых различных клетках и тканях. Они локализуются в цитоплазме и митохондриях, могут быть выявлены цитохимически при экспозиции клеток с соответствующим субстратом, на который дегидрогеназы действуют в присутствии тетразолиевых соединений, способных акцептировать протоны, с образованием нерастворимых окрашенных соединений.

Нормальные величины. У здоровых людей СДГ и α-ГФДГ выявляются в виде гранул синего цвета в нейтрофилах, лимфоцитах, тромбоцитах периферической крови и миелобластах, гранулоцитах, мегакариоцитах, эритро- и нормобластах костного мозга.

СЦК СДГ лимфоцитов составляет 1,10±0,05; α-ГФДГ — 0,80±0,08. У детей активность СДГ выявляется в 46 % лимфоцитов. У взрослых в пунктате костного мозга 88 % недифференцированных клеток имеют активность фермента (+), все ядросодержащие клетки эритроидного ряда и гранулоциты проявляют активность на (+) или (++).

Клиническое значение . Повышение активности СДГ и α-ГФДГ в гранулоцитах обнаружено у больных со злокачественными опухолями. Снижение активности выявляется в лимфоцитах в период приступа бронхиальной астмы, при хроническом лимфолейкозе, в гранулоцитах — при хроническом миелолейкозе.

источник

Современные подходы к оценке и коррекции состояния ряда энергообеспечивающих систем организма в норме и при наличии патологии Цитохимия — раздел цитологии, изучающий биохимическими методами строение и функции клеток, внутриклеточных структур

Современные подходы к оценке и коррекции состояния ряда энергообеспечивающих систем организма в норме и при наличии патологии

Цитохимия — раздел цитологии, изучающий биохимическими методами строение и функции клеток, внутриклеточных структур и продуктов их жизнедеятельности [1].

Рассматривая проблемы формирования здоровья с позиций фундаментального уровня организации — клеточного, мы получаем возможность вынести более детальное и объективное суждение о состоянии здоровья пациента. Изменения на клеточном уровне появляются зачастую до формирования клинических симптомов болезни и сохраняются некоторое время после их купирования. Ориентируясь на результаты научных исследований, проведенных сотрудниками лаборатории цитохимии НЦЗД РАМН под руководством Р. П. Нарциссова, можно с уверенностью утверждать, что ребенок в семье должен быть не просто желанным — к его рождению необходимо серьезно готовиться. Ни для кого не секрет, что здоровье женщины репродуктивного возраста до беременности определяет состояние здоровья ее будущего ребенка [2, 3, 4]. При этом зачастую оказывается, что отсутствие клинических симптомов заболевания на момент осмотра не является истинным показателем здоровья. В медицине в связи с этим принят термин условного здоровья. При лабораторном и инструментальном обследовании могут быть выявлены симптомы хронических заболеваний, находящихся в стадии ремиссии, персистирующие вирусные инфекции, нарушения липидного обмена. Все эти состояния неизбежно будут влиять на состояние энергетического метаболизма клеток и приводить к формированию тканевой гипоксии, которая, в свою очередь, может являться пусковым механизмом для формирования целого ряда дисфункций различных органов и систем, в том числе и репродуктивной системы.

Клиническая цитохимия, основанная на количественном цитохимическом анализе лимфоцитов, является неспецифическим методом диагностики энергодефицитных состояний [4, 5]. Ориентируясь на объективную оценку активности окислительно-восстановительных и гидролитических внутриклеточных ферментов, этот метод позволяет патогенетически обоснованно подойти к коррекции выявленных нарушений и подобрать терапию препаратами метаболического действия.

Количественный цитохимический анализ лимфоцитов периферической крови с успехом применяется в различных областях медицины — акушерстве, гинекологии, педиатрии, хирургии, поскольку позволяет обоснованно корректировать нарушения энергообмена клеток, которые неизбежно сопровождают любой патологический процесс. Использование данного метода диагностики в программе подготовки супружеских пар к беременности позволяет проводить терапию препаратами-метаболитами, оптимизировать энергообмен у будущих родителей и таким образом профилактировать развитие патологии у будущего ребенка [6, 7]. Контроль за состоянием энергетического обмена у беременной женщины позволяет своевременно выявлять тканевую гипоксию плода и вовремя принимать меры по ее коррекции [8, 9, 10]. Существует прямая зависимость между цитохимическими показателями беременной женщины и гистохимическими показателями развивающегося плода. Показатели ферментного статуса лимфоцитов женщины на 7–10-й нед беременности являются прогностически значимыми для оценки состояния энергетического обмена у развивающегося ребенка в течение всей беременности [6, 11]. Не менее важно и динамическое наблюдение за состоянием энергетического обмена у детей различного возраста, особенно у новорожденных и детей первого года жизни. Изменения энергетического метаболизма клеток головного мозга, кардиомиоцитов, эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника у новорожденного ребенка, перенесшего хроническую антенатальную или острую интранатальную гипоксию, приводят к формированию дисфункций вышеперечисленных органов, что нарушает процессы адаптации новорожденного ребенка [12]. Становится очевидным, что терапия подобных дисфункций без коррекции нарушений энергетического обмена клеток выглядит по меньшей мере некорректной, тем более что при своевременно назначенной обоснованной метаболитной терапии подобные дисфункции могут не развиться.

В настоящий момент накоплен большой клинический материал по применению различных метаболических комплексов под контролем показателей количественного цитохимического анализа крови при лечении различной патологии. Разработаны схемы метаболитной терапии, назначаемые в зависимости от показателей цитохимического исследования крови и лежащие в основе профилактики развития патологии беременности. Применение этих схем при подготовке к беременности и во время нее позволяет оптимизировать процессы энергообмена и, таким образом, снижает риск перинатальной патологии у будущего ребенка [7, 8].

В программе подготовки к беременности исследование проводится в начале и середине менструального цикла. Оценивается динамика цитохимических показателей в эти декретированные сроки и производится подбор конкретных метаболических комплексов [7].

В настоящий момент с успехом применяется компьютерная обработка цитохимических показателей — цитохимическая экспертиза состояния здоровья [13]. Заключение экспертизы включает рекомендации по метаболитной терапии с указанием конкретных препаратов, показанных пациенту в зависимости от выявляемых у него изменений функционирования энергообеспечивающих систем. В рамках цитохимической экспертизы состояния здоровья проводится оценка активности двух митохондриальных окислительно-восстановительных ферментов — сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) и одного лизосомального гидролитического фермента — кислой фосфатазы (КФ). Показатели активности митохондриальных ферментов отражают эффективность работы митохондриального аппарата, т. е. обеспеченность клеток энергоемкими соединениями, а характеристика активности кислой фосфатазы маркирует разрушение таких клеточных органелл, как лизосомы и, таким образом, опосредованно позволяет оценивать стабильность клеточных мембран.

В отличие от обычных биохимических исследований, при которых активность фермента (щелочной фосфатазы, ЛДГ и др.) характеризуется только средними цифровыми значениями, цитохимический анализ предусматривает определение активности фермента в целой клеточной популяции. Вполне естественно, что в клеточном пуле клетки находятся на разных уровнях функциональной активности. Соответственно, активность энергетических ферментов в клетках разная, что позволяет выделить различные клеточные субпопуляции, различающиеся по активности фермента. Цитохимическая экспертиза предусматривает описание характеристик клеточного распределения, которые даются как в цифровых значениях, так и в виде графика. Нормативное распределение в состоянии здоровья характеризуется наличием единичных высокоактивных клеток и единичных низкоактивных. Основная масса клеток распределяется вокруг средних значений активности фермента.

Изменение структуры клеточной популяции с преобладанием высоко- или низкоактивных клеток неспецифично и может наблюдаться при различных заболеваниях, так как характеризует фундаментальный уровень организации. С другой стороны, данные параметры распределения клеточной популяции по активности фермента дают представление о фазе течения заболевания (рис. 1), что может использоваться для прогноза его течения и обоснованной ступенчатой терапии, направленной на восстановление энергетического баланса в патологически измененных тканях и органах.

Кроме исследования активности митохондриальных ферментов в цитохимической экспертизе проводится анализ активности лизосомального фермента — кислой фосфатазы. Избыточное ее количество в цитоплазме клеток свидетельствует о разрушении лизосом и нестабильности клеточных мембран, что характерно для высокой сенсибилизации организма или конституциональной особенности пуринового обмена с предрасположенностью к дисметаболическим нарушениям.

Совокупность выявленных цитохимических изменений определяет направленность метаболитной терапии. При низких показателях активности митохондриальных флавопротеидов пациенту назначаются кофакторы цикла трикарбоновых кислот. Основу этого комплекса составляют липоевая кислота, кокарбоксилаза, рибофлавин мононуклеотид, пантотенат кальция. В ситуациях ярко выраженной депрессии дегидрогеназ — сукцината и a-глицерофосфата в основной комплекс добавляются препараты, содержащие субстраты цикла трикарбоновых кислот — янтарную и лимонную кислоты, а также переносчик жирных кислот через мембрану митохондрии — карнитин (рис. 1). В случаях высоких показателей активности митохондриальных ферментов и кислой фосфатазы пациенту назначаются вещества, стабилизирующие клеточные мембраны. Эти препараты, объединенные в комплекс, содержат доноры метильных или формильных групп и соответствующие кофакторы (кобаламин, фолиевая кислота), источник аминогрупп и кофактор переаминирования (гистидин и пиридоксальфосфат), метаболиты — предшественники пиррольного кольца (глицин и глутаминовая кислота), инозин и оротат как источники пуринов и пиримидинов (рис. 2) [14].

Возвращаясь к вопросам подготовки и ведения беременности, нужно признать, что метаболитная коррекция нарушений энергетического обмена у женщин должна быть первой ступенью медицинской помощи. Она представляет собой наиболее физиологическое медикаментозное пособие, позволяющее в большинстве случаев повысить эффективность любого базового лечения, а часто и просто избежать его.

Накопленный клинический опыт позволяет с высокой степенью вероятности прогнозировать изменения цитохимических показателей при различной патологии. Например, основная масса острых воспалительных процессов, антигенная стимуляция неинфекционной природы, любые интенсивные стрессирующие воздействия на организм сопровождаются повышением активности митохондриальных ферментов, что требует назначения второго метаболического комплекса (рис. 2). Что касается хронических воспалительных процессов, протекающих в любых органах или системах, для них характерно истощение энергетического обмена со снижением активности митохондриальных ферментов, в такой ситуации показано назначение первого метаболического комплекса (рис. 1) [15, 16].

С другой стороны, существует целый ряд состояний, связанных с наличием астенического синдрома, чрезмерными физическими, психоэмоциональными или интеллектуальными нагрузками, при которых развивается глубокий энергодефицит, обусловленный недостаточным поступлением субстратов энергетического обмена в клетку. В данном случае клетки находятся в состоянии энергетического голода и адекватно ответить на инфекцию не могут. В такой ситуации даже острый воспалительный процесс не будет сопровождаться адекватным повышением митохондриальной активности [15, 16]. Эти состояния зачастую формируют те вторичные иммунодефициты, когда изменений в количественном составе иммунокомпетентных клеток при иммунологических исследованиях не выявляется, а причина частой заболеваемости до конца не ясна. Само по себе частое чередование инфекционных процессов также сопровождается развитием энергодефицитных состояний и снижением функциональной активности иммунокомпетентных клеток вследствие их энергетического голода. Назначение метаболитной терапии в подобной ситуации приводит к нормализации энергетического обмена в клетках, что влечет за собой восстановление функции иммунной системы. Это легко проиллюстрировать на примере группы часто и длительно болеющих детей. Зачастую проведение нескольких курсов обоснованной по результатам цитохимического анализа крови метаболитной терапии приводит к значительному снижению как количества заболеваний у этих детей, так и их продолжительности.

Никто сегодня не сомневается в необходимости проведения профилактических курсов витаминотерапии. Терапия поливитаминными препаратами является одной из разновидностей метаболитной терапии. При сравнительной оценке эффективности коррекции нарушений энергообмена поливитаминными комплексами и индивидуально подобранными препаратами метаболического действия под контролем цитохимического анализа, индивидуальная метаболитная терапия явно превосходит поливитаминные комплексы.

В настоящий момент на основании цитохимических исследований энергетического обмена разработан целый ряд комбинированных препаратов метаболического действия. Известно, что парентеральное введение препаратов-метаболитов более эффективно, по сравнению с энтеральным, и это резко ограничивает назначение данных препаратов в амбулаторной практике. Как альтернатива парентеральному пути введения в настоящий момент предлагаются препараты-метаболиты в виде ректальных суппозиториев. Биодоступность препаратов при подобном пути введения значительно повышается и по степени эффективности не уступает той, которая наблюдается при парентеральном пути введения. Уже сейчас на фармацевтическом рынке появился метаболический комплекс для ректального введения, содержащий кокарбоксилазу, рибофлавин мононуклеотид и липоевую кислоту — корилип. При разработке подобных комплексов основное внимание уделяется синергизму действия препаратов при коррекции биохимических процессов в клетке. В настоящий момент для оптимизации энергетического обмена широко используется лекарственный препарат, объединяющий в своем составе основные субстраты цикла Кребса — лимонную и янтарную кислоты — лимонтар. Метаболический комплекс, интенсифицирующий окисление субстратов в цикле Кребса, содержащий незаменимую аминокислоту L-треонин и пиридоксин гидрохлорид — биотредин.

Таким образом, на данном этапе у практикующих врачей имеется реальная возможность использовать количественный цитохимический анализ лимфоцитов периферической крови как неспецифический метод диагностики состояния энергообеспечивающих систем организма и обоснованно назначать своим пациентам ту метаболитную терапию, которая объективно показана им в связи с выявляемыми у них изменениями.

По вопросам литературы обращайтесь в редакцию.

Т. Д. Измайлова, кандидат медицинских наук
С. В. Петричук, доктор биологических наук
В. М. Шищенко, доктор медицинских наук, профессор
И. В. Писарева
Лаборатория цитохимии НЦЗД РАМН, Москва

источник

Способ прогнозирования митохондриальных заболеваний у детей с недифференцированными формами задержки нервно-психического развития (варианты)

Владельцы патента RU 2366959:

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии. Для осуществления способа прогнозирования митохондриальных заболеваний у детей с недифференцированными формами задержки нервно-психического развития проводят цитохимический анализ активности ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови. Далее определяют активность ферментов СДГ, ГФДГ, ГДГ, МДГ, ЛДГ, вычисляют соотношение активности ГФДГ к активности СДГ, величину сигмального отклонения количественного признака активности ферментов и величину соотношения активности ГФДГ к активности СДГ с учетом возраста пациента. Или определяют показатель площади всех гранул фермента СДГ, показатель эллипса кластеров ГФДГ, интегральную оптическую плотность всех гранул ГДГ, площадь всех мелких гранул ЛДГ и величину сигмального отклонения показателя каждого фермента с учетом возраста. Исходя из полученных данных определяют митохондриальный цитохимический коэффициент (МЦК) и по увеличению МЦК судят об увеличении вероятности развития митохондриального заболевания. Использование изобретения позволяет получить адекватную информацию о состоянии энергетического обмена, используя минимальное количества необходимого материала, и обеспечивает щадящие (малоинвазивные) условия обследования больного. 2 н.п. ф-лы, 7 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии. Способ основан на использовании простого и малоинвазивного метода выявления митохондриальной недостаточности и нарушений клеточной биоэнергетики у детей с недифференцированными формами задержки нервно-психического и физического развития на основании цитохимического анализа активности ферментов энергетического обмена в лейкоцитах периферической крови. Отсутствие адекватных, относительно простых и малотравматичных методов исследования до настоящего времени тормозило создание диагностических программ, направленных на раннее выявление наследственных нарушений биоэнергетического обмена у детей. Техническая сложность, высокая стоимость и инвазивность некоторых диагностических методов, принятых в мировой практике в качестве стандартных способов диагностики нарушений клеточной энергетики [в частности, биопсии скелетной мышцы (прототип) (Клембовский А.И., Сухоруков В.С. Митохондриальная недостаточность у детей. Арх. патол. 1997; 59:5:3-7) и молекулярно-генетического анализа], затрудняет их использование для ранней диагностики митохондриальной патологии, лабораторного контроля над динамикой состояния больных, определения ожидаемого клинического эффекта терапии митохондриальных нарушений у детей.

Целью разработки способа и изобретения является получение адекватной информации о состоянии энергетического обмена посредством минимального количества материала, необходимого для исследования, то есть обеспечивающего щадящие (малоинвазивные) условия обследования больного.

Цитохимический анализ ферментного статуса дегидрогеназ лимфоцитов периферической крови (сукцинатдегидрогеназы, альфаглицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы) предлагается как метод ранней диагностики митохондриальной недостаточности. Данные энзимы занимают ключевые позиции в аэробном и анаэробном энергообеспечении клетки и снижение их активности является маркером митохондриальной дисфункции.

Способ информативен, полученные результаты адекватно отражают состояние процессов клеточного энергообмена. Доказательством адекватности применения морфометрического анализа лимфоцитов при митохондриальных болезнях является установленная корреляция функциональной активности митохондрий лимфоцитов с тестом RRF («рваные» красные волокна) в биоптатах мышц.

Показаниями к применению метода цитохимического анализа являются: недифференцированная задержка статико-моторного, психоречевого и физического развития; респираторный и нейродистресс-синдромы в раннем возрасте; повышенная утомляемость, мышечная слабость и гипотония, непереносимость физической нагрузки, птоз, офтальмоплегия, боли в мышцах, судороги, миоклонии, атаксия, нистагм, головные боли, спастические парезы, периферическая нейропатия; повторная рвота, не связанная с приемами пищи; нарушения сердечного ритма, кардиомиопатия (дилатационная или гипертрофическая); снижение зрения: пигментный ретинит, атрофия зрительного нерва; тугоухость; почечные тубулярные нарушения; нарушение функции печени; особенности генеалогии (наличие аналогичных случаев патологии у сибсов и других родственников; выкидыши, мертворождения у матери пробанда); повышенный уровень молочной и пировиноградной кислот в крови натощак. Противопоказаниями к применению метода цитохимического анализа являются: прием пациентом витаминов, кофакторов метаболических реакций (пантотенат или пангамат кальция, оротат калия, липамид или липоевая кислота, фолиевая кислота и др.), стимуляторов энергетического обмена (янтарная кислота, препараты карнитина, коэнзим Q и др.), гормональных препаратов (L-тироксин и др.), некоторых антиконвульсантов (производные вальпроевой кислоты, фенобарбитал), хлорамфеникола (левомицетин), некоторых антидепрессантов и анальгезирующих средств; острые воспалительные заболевания или хронические болезни в стадии обострения или неполной ремиссии. При условии наличия одного из этих факторов необходимо указывать это в сопроводительном документе.

Материально-техническое обеспечение метода: световой микроскоп; микроскоп с видеокамерой; предметные стекла; покровные стекла; одноразовые скарификаторы; дистиллированная вода; фиксатор (ацетон-трилон); весы; термостат; наборы реактивов фирмы ООО МНПК «Химтехмаш», ГосНИИ «ИРЕА»; компьютер; программа «Видеотест».

Цитохимическое выявление активности митохондриальных ферментов осуществляли наборами реактивов фирмы ООО МНПК «Химтехмаш», ГосНИИ «ИРЕА»: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) лейкоцитов периферической крови (метод Пирса (1957) в модификации Р.П.Нарциссова (1986) с последующей визуальной и компьютерной морфометрией (пакет программ «Видеотест», методика B.C.Сухорукова, Е.В.Тозлиян). Ферментативная активность при визуальной морфометрии выражалась в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. С помощью последующей компьютерной телеметрии определяли количество депозитов, их площадь, интервал яркости (разнородность), среднюю оптическую плотность, интегральную оптическую плотность гранул.

В качестве контрольных использовались параметры исследуемых ферментов, полученные при проведении морфометрического анализа у 55 практически здоровых детей.

Для мазка на предметные стекла (5 стекол — 5 ферментов) необходимо 5 капель крови из пальца. Стекла маркируются, фиксация мазков производится в ацетон-трилоне в течение 40 секунд — 1 минуты, после высыхания (около 20 минут) образцы опускаются в бюксы с соответствующим реактивом и ставятся на 1 час в термостат или на водяную баню. Затем дважды промываются в чистой воде и сушатся.

В световом микроскопе подсчитывается количество гранул в 30-50 клетках (малых лимфоцитов) и выводится средняя количественная оценка (активность фермента в условных единицах, среднее количество гранул в лимфоците, гр/лф., оцениваются также качественные параметры гранул (форма, размеры, распределение, интенсивность окрашивания, тенденция к кластерообразованию).

Балльная оценка качественных параметров гранул при визуальной оценке представлена в таблице 1.

Таблица 1.
Балльная оценка качественных параметров гранул (цитохимический метод).
0 баллов 1 балл 2 балла
Не изменены (отсутствуют кластеры, нормальная форма и размер гранул, нормальное распределение гранул). Умеренные изменения (единичные кластеры, наличие мелких гранул, нарушение распределения гранул в некоторых клетках) Выраженные изменения (кластерообразование, обилие мелких гранул, выраженные нарушения распределения гранул во всех клетках).

Введение балльной системы было необходимо для оценки тяжести проявлений и последующей статистической обработки полученных данных.

Для компьютерной морфометрии мазки заключаются под покровные стекла (для этого используется разогретый желатиновый раствор). Методом компьютерного анализа оцениваются следующие параметры: площадь гранул, эллипс, интервал яркости, средняя оптическая плотность, интегральная оптическая плотность по всем гранулам, мелким, средним, кластерам 5-ти определяемых ферментов.

Так как в литературе отсутствуют данные по морфометрическим показателям исследуемых нами ферментов у здоровых детей разного возраста, нами исследована активность сукцинатдегидрогеназы, α-глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы по возрастам. Результаты представлены в таблице 2. Эти данные необходимы для проведения сравнительного анализа между результатами у исследуемого пациента и нормой и вывода заключения о наличии или отсутствии нарушений в активности ферментов энергетического обмена у данного пациента.

Таблица 2.
Пределы показателей активности митохондриальных ферментов и их соотношений в лимфоцитах периферической крови (визуальная оценка) у здоровых детей.
До 1 года (n=15) 1-4 года (n=10) 5-12 лет (n=15) 13-18 лет (n=15)
сукцинатдегидрогеназа 13,3-18,6 14,5-18,8 18,0-23,0 18,5-21,5
α-глицерофосфатдегидрогеназа 5,6-9,9 7,5-9,5 11,0-14,0 11,0-14,0
глутаматдегидрогеназа 7,5-11,7 7,0-10,0 10,0-15,0 10,0-15,0
малатдегидрогеназа 9,0-15,0 10,0-13,0 9,0-13,0 9,0-13,0
лактатдегидрогеназа 10,0-20,0 8,0-18,0 10,0-17,0 10,0-17,0
ГФДГ/СДГ(К1) 0,37-0,69 0,4-0,55 0,5-0,7 0,5-0,7
ГДГ/СДГ (К2) 0,41-0,75 0,4-0,65 0,6-0,8 0,6-0,8
ГФДГ/ГДГ (К3) 0,55-1,2 0,8-1,35 0,7-1,2 0,7-1,2
Условные обозначения: ГФДГ/СДГ (K1) — соотношение активности α-глицерофосфатдегидрогеназы к сукцинатдегидрогеназе, ГДГ/СДГ (К2) — соотношение активности глутаматдегидрогеназы к сукцинатдегидрогеназе, ГФДГ/ГДГ (К3) — соотношение активности α-глицерофосфатдегидрогеназы к глутаматдегидрогеназе.

Для удобства интерпретации результатов морфометрического анализа активности митохондриальных ферментов нами предложены сигмальные таблицы: для визуального метода (таблица 3) и для компьютерного метода (таблица 4), а также формулы расчета митохондриального цитохимического коэффициента и таблицы вероятностей для каждого метода.

В группу сравнения (контрольная группа) вошли 55 здоровых детей. Дети этой группы были отобраны на педиатрическом приеме в день здорового ребенка в детской поликлинике. Возраст детей колебался от 1 месяца до 18 лет.

Для оценки диагностической ценности морфометрического метода использовался математический анализ (непараметрические методы, в частности анализ соответствий (или частотных таблиц), метод дискриминантных функций, корреляционный и факторный анализ). Диагностическая ценность визуального метода составляет 86%, а компьютерного анализа активности митохондриальных ферментов — 93%.

Подозрение на наличие митохондриальной недостаточности должны вызывать следующие изменения параметров морфометрического исследования (критерии разработаны в научно-исследовательской лаборатории общей патологии под руководством B.C.Сухорукова, в МНИИ педиатрии и детской хирургии):

— сочетанное снижение количества гранул определяемых ферментов (сукцинатдегидрогеназы, α-глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы) и выраженное кластерообразование (патологическое скопление большого количества гранул (митохондрий) у одного из полюсов клетки;

— изолированное снижение количества гранул одного из ключевых ферментов аэробного обмена — сукцинатдегидрогеназы и повышение количества гранул ключевого фермента анаэробного обмена лактатдегидрогеназы ;

— сочетанное снижение количества гранул α-глицерофосфатдегидрогеназы и глутаматдегидрогеназы ;

— изменение качественных параметров гранул изучаемых ферментов по результатам визуальной оценки (нарушение распределения гранул в клетке, изменение формы и размера гранул, наличие кластеров);

— сочетанное изменение параметров по результатам компьютерной морфометрии (снижение средней оптической плотности гранул, увеличение площади мелких и средних гранул, увеличение площади кластеров, уменьшение эллипса мелких и средних гранул, снижение интервала яркости мелких гранул; сочетанное изменение вышеперечисленных параметров) определяемых ферментов;

— выраженное повышение количества гранул сукцинатдегидрогеназы, α-глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы (при отсутствии признаков инфекционно-воспалительного процесса, хронической инфекции в стадии обострения или неполной ремиссии);

— снижение количества гранул сукцинатдегидрогеназы и повышение количества гранул α-глицерофосфатдегидрогеназы ;

— повышение оптических характеристик по всем гранулам определяемых ферментов.

С целью объективной оценки вышеперечисленных изменений морфометрических параметров с помощью методов математического анализа выделены наиболее значимые, на основании чего был разработан митхондриальный цитохимический коэффициент, предложена формула для его расчета (варианты).

Условные обозначения: СДГ — количество сигнальных отклонений количественного признака фермента сукцинатдегидрогеназы (определяется в соответствии с представленной таблицей), ГФДГ — количество сигмальных отклонений количественного признака фермента α-глицерофосфатдегидрогеназы (определяется в соответствии с представленной таблицей), ГДГ — количество сигмальных отклонений количественного признака фермента глутаматдегидрогеназы (определяется в соответствии с представленной таблицей), МДГ — количество сигмальных отклонений количественного признака фермента малатдегидрогеназы (определяется в соответствии с представленной таблицей), ЛДГ — количество сигмальных отклонений количественного признака фермента лактатдегидрогеназы (определяется в соответствии с представленной таблицей), КП — качественные параметры (в соответствии с балльной оценкой, таблица 1), К1 — коэффициент 1 (ГФДГ/СДГ- соотношение активности α-глицерофосфатдегидрогеназы к сукцинатдегидрогеназе) — определяется в соответствии с представленной таблицей.

МЦК до 3 — диагноз маловероятен;

МЦК от 3 до 6 — диагноз вероятен;

МЦК более 6 — вероятность заболевания высока (более 50 %).

Митохондриальный цитохимический коэффициент (МЦК) = СДГплощ.все*0,5+ГФДГ элл.кл.*0,7+ГДГ инт.о.пл.в*2,1+ЛДГ пл.мелк.*0,8
Таблица вероятностей
МЦК 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 4
Вероятность болезни 34% 41% 48% 55% 63% 70% 93%
Количество больных 93% 93% 93% 93% 93% 92% 91%

Условные обозначения: СДГпл.все — сукцинатдегидрогеназа площадь всех гранул в сигмах по таблице, ГФДГэлл.кл. — глицерофосфатдегидрогеназа эллипс кластеров в сигмах по таблице, ГДГинт.опт.пл.в. — глутаматдегидрогеназа интегральная оптическая плотность всех гранул в сигмах по таблице, ЛДГпл.мелк. — лактатдегидрогеназа площадь мелких гранул в сигмах по таблице.

МЦК до 3 — диагноз маловероятен;

МЦК от 3 до 3,2 — диагноз вероятен;

МЦК более 3,2 — вероятность заболевания высока (более 50%).

Таким образом, определяют активность ферментов сукцинатдегидрогеназы, глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, вычисляют соотношение активности глицерофосфатдегидрогеназы к активности сукцинатдегидрогеназы, определяют величину сигмального отклонения количественного признака активности каждого из вышеперечисленных ферментов и соотношения активности глицерофосфатдегидрогеназы к активности сукцинатдегидрогеназы с учетом возраста в соответствии с разработанной таблицей № 3; определяют качественные показатели (КП) гранул в баллах: 0 — не изменены, т.е.отсутствуют кластеры, нормальная форма и размер гранул, нормальное распределение гранул; 1 — умеренные изменения, т.е.единичные кластеры, наличие мелких гранул, нарушение распределения гранул в некоторых клетках; 2 — выраженные изменения, т.е. кластерообразование, обилие мелких гранул, выраженные нарушения распределения гранул во всех клетках; исходя из полученных данных определяют суммарный морфометрический показатель — митохондриальный цитохимический коэффициент (МЦК) по формуле

где СДГ, ГФДГ, ГДГ, МДГ, ЛДГ — величины сигмальных отклонений активности каждого из ферментов, соответственно, определенные в соответствии с таблицей № 3;

K1 — коэффициент, равный величине сигмального отклонения соотношения активности глицерофосфатдегидрогеназы к активности сукцинатдегидрогеназе, определенный в соответствии с таблицей №3;

КП — качественные параметры в баллах.

По увеличению показателя МЦК судят об увеличении вероятности развития митохондриального заболевания, при этом при значениях МЦК до 3 — диагноз маловероятен (до 11%); при значениях МЦК от 3 до 6 — диагноз вероятен (11-49%); при значениях МЦК более 6 — вероятность заболевания высока (более 50 %).

С помощью компьютерного морфометрического анализа активности ферментов биоэнергетического обмена лимфоцитов периферической крови определяют: показатель площади всех гранул фермента сукцинатдегидрогеназы, показатель эллипса кластеров фермента глицерофосфатдегидрогеназы, интегральную оптическую плотность всех гранул фермента глутаматдегидрогеназы, площадь мелких гранул фермента лакататдегидрогеназы; определяют величину сигмального отклонения соответствующего показателя каждого из вышеперечисленных ферментов с учетом возраста в соответствии с разработанной таблицей №4, исходя из полученных данных определяют суммарный морфометрический показатель — митохондриальный цитохимический коэффициент (МЦК) по формуле:

СДГпл.все*0,5+ГФДГэлл.кл.*0,7+ГДГинт.о.пл.в.*2,1+ЛДГпл.мелк.*0,8, где СДГпл.все, ГФДГэлл.кл., ГДГинт.опт.пл.в., ЛДГпл.мелк. — величины сигмальных отклонений каждого из соответствующих показателей вышеперечисленных ферментов, определенные в соответствии с таблицей №4,

По увеличению показателя МЦК судят об увеличении вероятности развития митохондриального заболевания, при этом при значениях МЦК до 3 — диагноз маловероятен (до 34%); при значениях МЦК от 3 до 3,2 — диагноз вероятен (34-48%); при значениях МЦК более 3,2 — вероятность заболевания высока (более 50 %).

Таким образом, митохондриальный цитохимический коэффициент (МЦК) — это суммарный морфометрический показатель, получаемый при анализе цитохимической активности митохондриальных ферментов, указывающий на вероятность наличия у данного пациента нарушений клеточной биоэнергетики.

Эффективность использования метода

В отделении врожденных и наследственных заболеваний Московского НИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава было осмотрено 135 детей с недифференцированной задержкой нервно-психического и нарушениями физического развития. Возраст детей колебался от 4 месяцев до 18 лет. На основании наличия недифференцированной задержки нервно-психического и физического развития в сочетании с повышенной утомляемостью, мышечной слабостью и гипотонией, особенностями анамнеза и генеалогии, повышенным уровнем молочной и пировиноградной кислот в крови натощак, было выделено 100 детей, которым для установления диагноза было проведено морфометрическое исследование активности ферментов энергетического обмена и комплексное клинико-лабораторное обследование.

На основании результатов комплексного обследования все дети были разделены на 3 группы. В первую группу вошло 30 детей с митохондриальными заболеваниями и органическими ацидемиями, в том числе: с синдромами MELAS (n=2), Кернса-Сейра (n=5), D >

Вторую группу составили 19 детей с наследственными заболеваниями, сопровождающимися нарушениями нервно-психического и физического развития и признаками митохондриальных нарушений: синдромами Элерса-Данлоса (n=4), Марфана (n=3); тапеторетинальной абиотрофией (n=5), синдромами Ретта (n=4), Лоу (n=1), Аарскога (n=1), галактоземией (n=1).

В 3-ю группу вошел 51 ребенок, у которого при обследовании не было установлено признаков митохондриальной дисфункции. Из них у 24-х нарушения в нервно-психическом и физическом развитии были обусловлены последствиями неблагоприятного течения беременности и родов. У остальных детей были диагностированы: алкогольная эмбриофетопатия, лейкоэнцефалит, некоторые наследственные нервно-мышечные заболевания.

Большая часть детей (68%) была старше 5 лет. Соотношение мальчиков и девочек примерно одинаково.

Характеристика параметров цитохимического анализа активности ферментов энергетического обмена в разных группах обследованных детей в возрасте 5-15 лет представлена в таблице 5.

источник



Источник: domofoniya.com


Добавить комментарий